中国生物工程杂志

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马义1,李弘剑2,周天鸿2

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 1-06.

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为研究利用基因重组方法生产人胰高血糖素样肽-1（GLP-1）衍生多肽的最佳表达及纯化条件，选用大肠杆菌偏爱密码子，以含人GLP-1的质粒为模板，用PCR方法合成全长人GLP-1衍生多肽基因，并定向插入到高效表达载体pMFH中，用大肠杆菌BL21进行表达，融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后，用C18 Sep-Pak 反相柱脱盐，然后融合蛋白经甲酸水解，水解产物经Ni-NTA柱和高效液相色谱（HPLC）纯化制备后,目的肽由质谱鉴定。实验结果表明：利用载体pMFH在BL21中，GLP-1衍生物的最佳诱导表达温度为37℃、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的最佳浓度为0.6mmol/L，最佳诱导表达时间为6h；HPLC分析和制备GLP-1衍生物最佳条件为：流动相A(10% CNCH3∶90% H2O,0.1％TFA)，流动相B(100% CNCH3,0.1% TFA)，流速1ml／min，30 min线性梯度洗脱，B相至70%，检测波长280nm；质谱鉴定GLP-1衍生物的分子量为5.492kDa，与理论值相符合。在最佳表达及纯化条件下可得GLP-1衍生多肽的产量可达到11.6mg/L发酵产物，纯度≥98%。

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siRNA表达载体对SW480细胞原癌基因Pokemon的抑制

郭睿,李喜霞,解军

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 7-13.

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观察siRNA表达载体对SW480细胞中Pokemon原癌基因的抑制效应，为进一步研究该基因的功能奠定基础。构建针对Pokemon基因的RNAi质粒表达载体，脂质体法转染人结直肠癌SW480细胞系，观察转染效率及细胞表型变化。稳定转染后，实时荧光定量PCR和Western blot检测SW480细胞中Pokemon mRNA及蛋白质的表达情况；MTT法检测siRNA对SW480细胞恶性增殖的影响；流式细胞仪分析细胞凋亡改变。镜下观察阳性转染率约36%，转染表达载体后细胞形态发生了显著变化；Pokemon mRNA及蛋白质的表达受到明显抑制：与阴性对照组相比，表达质粒产生的siRNA对Pokemon mRNA的抑制率在转染后24 h和48 h分别为34.2%和67.7%；对蛋白的抑制率在48 h和72 h分别为48.3%和73.6%。MTT法检测细胞生长曲线表明Pokemon抑制可使SW480细胞生长速度明显减慢；流式细胞仪分析显示转染Pokemon siRNA表达质粒后SW480细胞凋亡增加。构建的RNAi表达载体可以有效抑制SW480细胞中Pokemon基因的表达，并对SW480细胞的生长具有明显抑制及诱导凋亡作用。

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SHIP基因真核表达载体的构建、鉴定及其表达抑制白血病细胞增殖的实验研究

杨琳,罗建民,刘小军,成志勇,温树鹏,杜行严,杨晓阳,武学文

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 14-19.

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构建真核表达载体pCAG-IRES-SHIP-GFP，并观察其在K562细胞中的表达。将SHIP逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）产物克隆入pCAG-IRES-GFP，经酶切、PCR鉴定及测序分析，构建pCAG-IRES-SHIP-GFP重组真核表达载体；采用脂质体转染法将pCAG-IRES-SHIP-GFP及空载体转入K562细胞，实时荧光定量PCR（FQ-PCR）、Western blot方法检测转染前后K562细胞中SHIP mRNA和蛋白的表达及Akt磷酸化水平改变，MTT、流式细胞仪检测等方法观察野生型SHIP基因表达对白血病细胞K562凋亡的影响。结果显示重组后的pCAG-IRES-SHIP-GFP质粒已成功载入SHIP的全长编码基因，序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pCAG-IRES-SHIP-GFP的K562细胞中存在荧光分布。外源性SHIP基因表达能使K562细胞增殖受抑；Western blot检测提示K562细胞Akt308和Akt473的磷酸化水平为较转染前显著下调，分别为转染前的38.7%和36.8％（P＜0.01）。上述结果表明基因全长3.5kb的人野生型SHIP基因真核表达载体质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP构建成功，并在K562细胞中表达；外源性SHIP基因表达能使K562细胞凋亡增加；这些改变可能与p-Akt表达下调有关。

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人白细胞介素11的定点聚乙二醇修饰

李智华,胡满仓,阎玲梅,赵玉娇,杨旭,彭正华,徐维明,李健峰

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 20-24.

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利用人白细胞介素11（hIL-11）无半胱氨酸（Cys）残基这一特点，通过定点突变将一个Cys残基引入hIL-11的N末端。然后，利用与Cys 巯基特异性反应的mPEG-马来酰亚胺将mPEG偶联到预先选定的位点，经层析纯化得到hIL-11的定点PEG修饰物。利用依赖型细胞株7TD1测定其生物学活性，结果表明，其体外生物学活性保持原有hIL-11活性的30%左右。定点聚乙二醇修饰方法为定向改造hIL-11，提高其药效的应用研究打下基础。

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Rb蛋白功能缺陷降低肝细胞对TGF-β的敏感性

吴云忠

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 25-29.

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目的：探讨肝细胞内视网膜母细胞瘤（Rb）基因缺陷对转化生长因子-β（TGF-β）诱导的细胞周期静止的影响。方法：分离并培养原代肝细胞，特异性siRNA腺病毒封闭细胞内Rb基因表达后加入TGF-β诱导，然后MTT法检测细胞生长变化，流式细胞仪检测细胞周期变化，并用Western blot和荧光定量逆转录聚合酶反应（FQ-RT-PCR）法检测细胞中pRb、E2F、c-MYC和p16的表达变化。结果：原代培养肝细胞感染Rb-siRNA重组腺病毒后，正常对照肝细胞抑制率高于Rb基因封闭的肝细胞（69.76%，p<0.01），流式细胞检测可见对照组TGF-β诱导后处于G1期的肝细胞数明显增多（99.80%，p<0.05），而在Rb基因封闭组中，TGF-β诱导后各细胞周期分布与未诱导的正常肝细胞基本一致。Western blotting检测可见48h时对照组TGF-β诱导后，E2F和c-MYC蛋白表达减少而p16高表达，Rb基因封闭组TGF-β诱导后c-MYC表达减少而p16表达增高。结论：TGF-β可诱导肝细胞静止于G1期，而Rb基因功能缺陷的肝细胞对TGF-β的诱导敏感性显著降低。

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幽门螺杆菌Cag-PAI hp0525基因的克隆表达及其重组蛋白HP0525对SGC-7901细胞增殖的影响

母润红1,2,邵世和1,钟桥1,崔蕾蕾1,张成义2

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 30-35.

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目的：由于文献报道幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）是产生胃溃疡和胃癌的致病菌之一，一个重要的影响因素是由cag致病岛编码的四型分泌系统。Hp0525是Cag致病岛中重要成分，是一种内膜蛋白ATPase。而幽门螺杆菌中Cag蛋白的表达以及Cag PAI编码的各自蛋白功能研究得还很少，为进一步研究幽门螺杆菌的致病机制和研发幽门螺杆菌诊断试剂盒及疫苗，特克隆幽门螺杆菌NCTC 11637hp0525 (caga) 基因，并对其进行测序，构建原核重组质粒，表达HP0525蛋白，初步研究其对SGC-7901细胞增殖的影响。方法：应用PCR技术从H.pylori基因组DNA中扩增hp0525编码基因片段，克隆至pMD18-T载体后，再将其定向插入pET-30a载体中，双酶切鉴定筛选阳性克隆，以DNA自动分析仪进行序列测定。测序分析正确后，经IPTG诱导表达，表达蛋白以Ni2＋-NTA柱进行纯化，并经Western blot和MALDI-TOF鉴定，透析除盐后的蛋白，通过免疫新西兰大白兔和抗体效价的测定，纯化的蛋白作用于SGC-7901细胞，用MTT法检测蛋白对细胞增殖的影响。结果：成功克隆hp0525基因，全长993bp，编码330个氨基酸，与GenBank 公布的其他H.pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为97%~99%。工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带，相对分子质量为36 000，与预期一致，经Ni2＋-NTA柱纯化后可获得纯度为98％重组蛋白。蛋白作用于SGC-7901细胞后，结果呈现一定量的时间和剂量依赖性。它是一种ATPase，通过测定具有一定的活性。活性为4.40IU/ml结论：成功克隆hp0525基因，并在大肠杆菌BL21中表达，经过镍柱纯化后得到纯度较高的蛋白, MTT法来检测出重组蛋白抑制细胞增殖；同时具有一定的酶活力，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

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DC-SIGN蛋白在家蚕系统中的表达及生物活性研究

唐晖1,汤绍辉1,杨冬华1,吕正兵2,余威2,张耀洲2,周天鸿3,陈炫1,刘芳1,肖昕4

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 36-40.

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目的：构建人DC-SIGN基因片段的家蚕表达系统，进行目的产物表达、鉴定及生物活性分析。方法：从体外刺激分化的DC细胞中克隆出DC-SIGN cDNA，在家蚕表达载体pBacPAK8的BamHⅠ和EcoRⅠ位点构建成重组质粒pBacPAK8-DC-SIGN，与线性化的Bm-BacPAK6病毒基因组DNA共转染家蚕细胞，空斑筛选得到重组病毒Bm-BacPAK-DC-SIGN，重组病毒感染家蚕细胞BmN，Western blot检测表达产物；HIV-1包膜糖蛋白gp120与表达产物孵育检测其生物活性。结果：构建了稳定表达人DC-SIGN蛋白片段的家蚕杆状病毒表达系统；成功表达了DC-SIGN蛋白片段，且能特异性地与HIV-1包膜糖蛋白gp120结合。结论：成功地在家蚕杆状病毒表达系统中表达了人DC-SIGN蛋白片段，具有天然DC-SIGN蛋白样的生物活性，为其抗体制备及AIDS防治药物的研发奠定了基础。

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梅毒螺旋体重组抗原的表达及在梅毒血清学诊断中的应用

卢海蓉1,王晓红1,陈少娟1,王峰2,章刚1,黄德新1

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 41-45.

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目的：克隆、表达梅毒螺旋体（Treponema pallidum, Tp）膜蛋白TpN47、TpN17、TpN44.5和TpN15，建立双抗原夹心ELISA法，探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法：应用聚合酶链反应法（PCR）从Tp全基因组中扩增4个目的片段，克隆到载体pET-HT-JKM中，在BL21(DE3)plysS菌中诱导表达，Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白，辣根过氧化物酶标记，双抗原夹心酶联免疫吸附法检测人血清中的特异性IgM和IgG抗体。结果：成功表达了4种重组蛋白用作ELISA包被和酶标抗原检测国家Tp参比血清，特异性和灵敏度均为100％；检测385份临床血清样本，结果与TPPA法相比符合率达到99％（P＜0.01），灵敏度和特异性分别为98.2%（162/165）和99.5%（219/220）。结论：表达的4种重组抗原具有很好的生物活性，为理想的梅毒的血清学诊断用抗原。以这4种表达蛋白为基础建立的双抗原夹心ELISA法灵敏度高，特异性好，而且方法简单，结果客观，易于自动化操作，值得临床大力推广。

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糖基转移酶基因双敲除对依博素生物合成的影响

白利平1,谢鸿观1,单俊杰2,姜蓉1,张洋1,郭连宏1,李元1

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 46-51.

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以往研究已确定链霉菌胞外多糖依博素的生物合成基因簇(ste)， ste15 和ste22 分别编码葡萄糖糖基转移酶和鼠李糖糖基转移酶。现通过基因同源重组双交换，在ste15基因缺失突变株Streptomyces sp. 139 (ste15-) 基础上，再进行ste22 基因阻断，经Southern 杂交验证，得到了ste15 和ste22 双基因缺失突变株Streptomyces sp. 139 (ste15-ste22-)，并对该菌株进行了基因互补研究。双基因缺失株产生的胞外多糖与依博素相比，葡萄糖与鼠李糖含量明显降低，分子量下降，生物活性明显变弱。基因互补株产生的胞外多糖中葡萄糖与鼠李糖含量基本恢复至依博素水平，生物活性也显著提高。因此，进一步阐明了ste15和ste22基因参与了依博素生物合成中葡萄糖和鼠李糖重复单元序列的形成过程，在依博素的生物合成中起重要作用，变株产生的依博素新衍生物体内外生物学活性正在深入研究中。

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一种来源于链格孢菌的MAPK激酶AtPBS2基因的克隆及功能分析

冯飞1,纪春艳2,杨秀芬3,曾洪梅3,邱德文3

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 52-57.

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通过遗传学手段，构建了细极链格孢菌（Alternaria tenuissima）cDNA酵母表达文库并筛选获得MAPK激酶AtPBS2基因，该基因全长2 492bp，编码683个氨基酸。AtPbs2p与来源于烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的AtPbs2p（XP_752961）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的NcPbs2p（XP_965727）、稻瘟菌（Magnaporthe grisea）MGCH7（XP_001522946）及酵母（Saccharomyces cerevisiae）ScPbs2p（EDN63254）序列分别具有52%、52%、49%和47%的相似性。在高渗环境下，AtPBS2基因与酵母的ScPBS2基因功能相同，具有耐高渗透压环境的能力。细极链格孢菌（A.tenuissima）中存在HOG通路信号途径，AtPBS2基因可能与链格孢菌（A.tenuissima）的逆境适应性调节密切相关。

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热带假丝酵母XYL1在Pichia pastoris中的表达及固定化细胞发酵生产木糖醇

李静,何璇,张飞伟,苏艳秋,汪红,路芳慧,陈铁林,曹毅,乔代蓉

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 58-62.

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利用克隆获得的具有双重辅酶依赖性的热带假丝酵母xyl1基因，通过表达载体pGAPZB转入巴斯德毕赤酵母X-33，采用海藻酸钙凝胶包埋法固定该重组菌，研究固定化条件下玉米芯水解液的发酵特性，实现对玉米芯等农业废弃物资源的利用。结果表明，转化xyl1基因的巴斯德毕赤酵母X-33的总酶活达到1.64U/mg。固定化细胞的最适发酵条件为pH 6.0、30℃、接种量20%、装液量28%、转速130r/min，木糖醇转化率为37.5%。为生物转化法大规模生产木糖醇以及乙醇提供新的选择途径。

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一株产凝集素的三叶半夏内生真菌的研究

张晓含,竺锡武,谭济才,陈集双

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 63-67.

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研究三叶半夏内生真菌及其凝集素，旨在为半夏内生真菌及其凝集素的开发利用提供依据。对三叶半夏块茎内生真菌分离、纯化，液体发酵培养代谢产物，无水乙醇提取总蛋白，兔血红细胞检测其凝集活性，筛选出菌株gs1，其总蛋白对兔血红细胞凝集活性显著。使用甘露聚糖-Sepharose 4B亲和层析柱纯化菌株gs1总蛋白，得到凝集素。Brandford法定量检测分析表明，1000 ml gs1发酵培养液中含有9.58 mg 凝集素。SDS-PAGE 电泳分析显示该凝集素为单一条带，分子量约为12 kDa。凝集活性实验表明，该凝集素对兔、大鼠和小鼠的血红细胞具有凝集作用，对兔血红细胞效果最显著；而对人（A＼B＼O＼AB型）和鸡的血红细胞无凝集作用。糖结合活性实验表明，甘露糖对该凝集素的凝集活性具有抑制作用。通过初步分类鉴定，菌株gs1为半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，曲霉属。

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植物乳杆菌Lp-2的高密度发酵

张广敏1,2,王炜1,3,包慧芳1,3,张晓琳1,2,詹发强,1,3,林瑞峰1,3

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 68-73.

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高密度培养植物乳杆菌是制作其发酵剂的重要环节。首先，研究了不同的溶氧和pH对植物乳杆菌的分批发酵的影响。在分批发酵的基础上，为进一步提高发酵液中的菌体浓度，进行了补料分批发酵实验。最终通过对蔗糖反馈补料发酵试验对比改造获得了pH反馈补料发酵工艺。此发酵补料工艺可以控制蔗糖残糖量始终处于较低的水平，因此获得了最高的菌体产量。菌体干重达到13.56g/L，较分批培养提高90.05%。

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高效发酵木糖生产乙醇酵母菌株的构建

李洁,李凡,刘晨光,任剑刚,赵心清,葛旭萌,白凤武

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 74-78.

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获得高效发酵木糖生产乙醇的酵母菌株是木质纤维素生物转化生产燃料乙醇的重要前提。在4%乙醇驯化的基础上，选择了乙醇耐性提高的休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）CICC1766菌株进一步进行紫外诱变，得到了木糖发酵性能较强的呼吸缺陷型突变体，并与乙醇发酵性能良好的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ATCC4126进行原生质体融合。采用单亲灭活法对休哈塔假丝酵母原生质体进行紫外灭活，在聚乙二醇（PEG）诱导下融合，对得到的融合子进行木糖发酵能力测定，选择到了一株能够更好地利用木糖产乙醇，并且木糖发酵性能比亲本得到明显提高的融合子F6，此融合子发酵50 g/L木糖，最高乙醇浓度达到18.75g/L，乙醇得率为0.375，达到理论转化值0.511的73.4%。与原始出发菌株CICC1766相比，乙醇产量提高了28%。

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表达载体pHsh对大肠杆菌热休克系统中负调控机制的影响

吴华伟1,邵蔚蓝2

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 79-84.

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pHsh是一种由σ32识别和启动外源基因表达的新型高效的大肠杆菌表达载体。正常E.coli细胞在热激诱导条件下，σ32的浓度在5 min内到达高峰，随后被3个负调控蛋白Dnak、DnaJ、GrpE结合导致失活或降解，整个热休克反应持续约12min。在携带有外源基因的高拷贝pHsh 的E.coli细胞中，外源基因却能持续高效表达4～10 h，这一现象表明了此时细胞中的σ32比没有携带质粒的细胞内σ32的浓度要高。σ32浓度的增高有可能是由于3个负调控蛋白Dnak、DnaJ、GrpE在细胞内的含量比正常情况下降低的结果。为了验证这一推测，从E.coli中克隆了Dnak、DnaJ、GrpE的编码基因，表达并初步纯化了其重组蛋白以作分子标记，采用双向电泳技术，分析携带质粒（pHsh+）和不携带质粒的E.coli(pHsh-)细胞在热休克后胞内蛋白质组的差异。该项实验通过与检索到的标准的E.coli蛋白质组图谱进行比较鉴别出的两个蛋白Dnak、GrpE，并通过对比目标点的大小和深浅发现pHsh+中的Dnak均少于pHsh─中的目标蛋白，所得结果与上述假设一致。

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高产吩嗪-1-羧酸（PCA）假单胞菌株M18G发酵优化模型的构建

李雅乾,蒋海霞,张雪洪,许煜泉

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 85-90.

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吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid, PCA）是促进根际生长假单胞菌分泌的重要抗菌物质。采用Plackett-Burman（PB）设计和响应面法（response surface method, RSM）对假单胞菌株M18（Pseudomonas sp. M18）的gacA基因突变株M18G的次级代谢产物PCA发酵的营养条件进行建模。运用Plackett-Burman（PB）设计试验，从12个营养成分中筛选出4个关键的组分，进而采用RSM 法对这4个因素进行中心组合设计试验，建立回归方程并进行统计学分析，绘制各营养因子之间的关系图。实验结果表明：建立的模型能合理地模拟并优化发酵中各参数及其浓度，确定发酵培养基的成分和浓度为：黄豆粉33.4g/L，葡萄糖12.7g/L，大豆蛋白胨10.9g/L和乙醇13.8 g/L, M18G菌株经60 h发酵培养，最高PCA产率能达到1.89 g/L，比优化前提高了6倍左右。各营养因子的等值线图表明黄豆粉和乙醇在PCA高产发酵中起到更为关键的作用，因此提供了提高PCA发酵产量的有效方法，并为其未来商业化应用奠定了基础。

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三角褐指藻基因枪转化体系的建立

路延笃,崔红利,秦松1,冯大伟,姜鹏2,衣悦涛1

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 91-96.

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三角褐指藻具有较高的脂肪酸含量，是一种很有潜力的生物柴油生产原料。此外，它是多不饱和脂肪酸尤其是二十碳五烯酸（EPA）重要的来源。合适转化体系的缺乏限制了通过基因工程手段对其进行改造。首次采用基因枪方法成功地将外源基因转入三角褐指藻，转化细胞经染色后呈现蓝色，表明外源报告基因β-糖苷酸酶( GUS ) 基因得到了成功的表达。同时还进行了转化参数等因素对转化效率影响的分析，优化了转化条件。结果显示最佳的转化条件为: 每60 μg钨粉包被1 μg质粒DNA，样品室真空度为27英寸汞柱，可裂膜为1500psi，受体与阻挡网距离6 cm。此外，转化载体采用了三角褐指藻内源基因fcp的启动子，实现了外源基因在细胞内的表达。通过5种基因工程中常用抗生素对三角褐指藻生长抑制的研究发现，三角褐指藻对卡那霉素、氨苄青霉素、链霉素和新霉素不敏感，500 mg/L 的卡那霉素、氨苄青霉素和新霉素，以及1000 mg/L 链霉素仍不能抑制其生长；三角褐指藻对氯霉素非常敏感，130 mg/L的氯霉素可以完全抑制其生长，其半抑制浓度为60 mg/L。这为基因工程手段改造三角褐指藻脂肪酸代谢相关途径奠定了基础。

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人精氨酸酶在毕赤酵母的高效表达、纯化和活性研究

马晓莉2,梁果义1

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 97-100.

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目的：人精氨酸酶（Arginase, Arg）的基因arg在毕赤酵母高效分泌表达，建立相应纯化工艺路线，研究重组人精氨酸酶的活性。方法：将人精氨酸酶基因arg按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9α信号肽基因后，构建得到重组毕赤酵母表达质粒。转化毕赤酵母GS115筛选高表达菌株。结果：成功构建了酵母表达载体pPIC-Arg，转化毕赤酵母GS115后筛选到分泌表达目的蛋白Arg的菌株，目标蛋白可以分泌到培养基中。经过膜过滤和凝胶过滤层析对培养基上清进行纯化，即可获得纯度达到95%的活性产物。活性测定表明，纯化的Arg比活性为310 IU/mg。结论：成功构建了Arg的毕赤酵母高效表达菌种，建立了目标物质的分离纯化工艺。

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基于串联质谱的鱼皮明胶鉴别研究

王前1,张贵锋2,刘涛2,刘永东2,马润宇1,苏志国2

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 101-107.

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在胶原蛋白序列比对基础上，以虹鳟鱼明胶、猪明胶和牛明胶为模型，利用高效液相色谱－串联质谱技术（HPLC-MS/MS）研究了3种明胶降解多肽组成的差异。使用胰蛋白酶将鱼皮明胶进行了酶解处理，使用HPLC-MS/MS对酶解产物中的多肽组成进行了分析，并与猪和牛明胶酶解产物中的多肽进行了比较。结果表明鱼明胶酶解产物中存在特征多肽，通过特征多肽的种类可区别鱼明胶与猪和牛明胶，研究了明胶多肽中脯氨酸羟基化修饰、明胶分子量范围和脱酰胺化对特征多肽识别的影响。研究表明利用HPLC-MS/MS技术通过识别明胶酶解产物中的特征多肽进行鱼皮明胶鉴别具有可行性。

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利用水稻启动子捕获系筛选水稻胚发育相关基因的初步研究

胡昌泉1,3,李素一1,2,刘华清2,刘次桃2,张晖1,2,潘大仁3,王锋1

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 108-112.

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通过对2227个启动子捕获系中报道基因β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,gus)表达活性检测，筛选到7个水稻胚中表达GUS活性的启动子捕获系，对其中编号为W9154的捕获系作了进一步分析。Southern杂交分析表明W9154是一个单拷贝T-DNA插入系，其T-DNA插入在水稻基因组第3号染色体上一个未知蛋白基因的第2个内含子中。对该未知蛋白基因上游调控序列生物信息学分析显示，其调控序列除含有TATA-box和CAAT-box等常见启动子元件外，还含有RY基序、E盒、G盒及AACA等种子特异性启动子的特征性元件。表达特征分析发现，编码上述未知蛋白的基因在野生型水稻的胚和茎中表达，这与捕获系W9154中GUS表达活性完全一致。这些表明启动子捕获系w9154捕获的候选基因可能是一个水稻胚发育相关基因。

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乳酸菌基因芯片应用研究进展

包秋华1,孙志宏1,乌日娜1,孟和2,张和平1

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 113-119.

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基因芯片技术是上世纪90年代兴起的一种对成百上千甚至上万个基因同时进行检测的新技术，具有高通量、并行化的特点，广泛应用于基因表达谱测定、基因功能预测、基因突变检测和多态性分析等方面。多种乳酸菌基因组全序列以及其大量EST、16S rDNA、16S-23S基因间区和功能基因序列测定的完成，有力地推动了基因芯片技术在乳酸菌研究中的应用。介绍了基因芯片的基本原理及乳酸菌基因芯片在基因表达、种属鉴定等研究中的应用进展，以期更好地利用和开发乳酸菌基因芯片。

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蛋白质组学技术在精子蛋白研究中的应用

韩伟东1,2,王栋1,郝海生1,赵学明1,杜卫华1,朱化彬1

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 120-124.

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从蛋白质组学研究的技术手段、蛋白质组学在人类不育及精卵相互识别并结合的机理研究、免疫法开展男性避孕方法的研究及蛋白质组学研究方法在家畜繁殖环节中的应用等几个方面阐述了蛋白质组学在人类生殖及动物繁殖环节相关研究中的重要作用。说明蛋白质组学已经成为生命科学未来发展的主要分支之一，为揭示生命个体的蛋白质动态变化提供了技术手段和理论基础，并将在药物开发，生命活动机理研究等方面发挥巨大作用，也必将会在家畜繁殖学领域发挥其应有的作用。

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PCR技术在性别鉴定及性别控制应用中的研究进展

林博,朱化彬,郝海生,杜卫华,赵学明,王栋

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 125-129.

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PCR技术是一项发展迅猛的生物技术，因具有快速、灵敏、简便及特异性强等特点而被广泛应用于性别鉴定及其它许多相关研究领域。应用于性别鉴定的PCR方法从简单PCR法、双重或多重PCR法、巢式PCR法发展到改进的两温度梯度PCR法；而不同性别间除了呈现有或无关系（类似于Sry 基因）的基因序列外，也检测到了很多类似于锌指蛋白和牙釉蛋白的呈现不同性别特征的基因序列，这为性别鉴定引物的设计和PCR法进行性别鉴定提供了另一种全新的思路，即如果根据这种性别多态性DNA序列特点设计引物，采用两温度梯度PCR扩增技术进行PCR性别鉴定，则可望简化鉴定程序、降低检测时间、提高鉴定效率，使PCR性别控制技术更加成熟和实用化。随着研究的深入，PCR技术在性别鉴定及控制的应用中必将日益成熟，并推动此项技术在其它相关领域中的研究和应用取得更大的进展。

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氨酰-tRNA合成酶的研究进展

周勤华1,周盛梅2

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 130-134.

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氨酰-tRNA合成酶催化特异的氨基酸与同源tRNA氨酰化，从而保证了遗传密码翻译的忠实性。这些古老而保守的蛋白质分子除了具有酶的功能外，在哺乳动物细胞中还发现了多种其他功能，具有重要的应用价值。在寻找具有全新作用机制的新抗生素以应对日益严重的抗生素耐药现象过程中，氨酰-tRNA合成酶是细菌蛋白质合成过程中重要的、新颖的靶标，成为关注的重点。定向突变的氨酰-tRNA合成酶可以用来定点掺入非天然氨基酸，扩展蛋白质工程。今后，随着人们对氨酰-tRNA合成酶研究的不断深入，它们还可能用来治疗肿瘤等多种疾病。

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真菌漆酶异源表达研究进展

刘志明1,郭丽琼1,2,林俊芳1,2

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 135-142.

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由于漆酶能够氧化芳香类化合物和其它一些非芳香类有机物，具有广泛的底物特异性，因此在纸浆漂白、纺织品染料脱色、有毒废弃物的去除、生物修复和生物传感器等方面具有巨大的应用潜力。但是缺少大量廉价的酶源供应阻碍了漆酶商业化的应用，解决这个问题的一个主要方法就是通过漆酶的异源表达来获得大量的漆酶。综述了真菌漆酶在酵母表达系统和丝状真菌表达系统中表达的研究结果，着重总结了影响漆酶异源表达的因素和提高漆酶表达的策略。

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木聚糖降解酶系基因代谢调控研究进展

王文雅1,刘卿1,傅晓蕾1,袁其朋1,2

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 143-150.

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木聚糖是半纤维素的主要组成部分，是一类数量很大的再生生物资源，工业利用前景广阔。木聚糖降解需要多种酶的参与，主要有木聚糖酶、木糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖酶、阿魏酸酯酶、p-香豆酸酯酶等。主要综述了木聚糖降解酶系基因代谢调控的研究进展，主要包括转录激活因子XlnR、抑制蛋白CreA、不同诱导物、pH值、HAP-CCAAT复合物等对木聚糖降解酶系基因表达的影响，最后探讨了木聚糖降解酶系基因代谢调控存在的问题，并对今后的研究进行了展望。

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世界主要国家的干细胞研究最新动态

杜艳艳

中国生物工程杂志. 2009, 29(06): 151-154.

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介绍了主要国家干细胞研究的政策支持、成果产出及市场需求动态。利用SCI引文数据库和Derwent数据库收录的论文和专利信息，对1995年~2008年主要国家干细胞研究的论文和专利进行了分析，以供我国干细胞研究者参考。

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2009年, 第29卷, 第06期　
刊出日期：2009-06-25

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