黑曲霉Aspergillus niger 963植酸酶基因phyA2 N-糖基化突变体的构建与表达分析

doi:Q789

中国生物工程杂志

2010, Vol. 30

Issue (06): 54-59 DOI: Q789

研究报告

黑曲霉Aspergillus niger 963植酸酶基因phyA2 N-糖基化突变体的构建与表达分析

殷亮¹,²,杨文竹²,王新宇¹,周蕴芝²,姚斌³,陈茹梅^2**,范云六²

1.兰州大学生命科学学院兰州 730000
2.中国农业科学院生物技术研究所北京 100081
3.中国农业科学院饲料研究所北京 100081

Construction and Expression Analyse of N-linked Glycosylation Site Mutants of phyA2 Gene from Aspergillus niger 963

YIN Liang^1,2,YANG Wen-zhu²,WANG Xin-yu¹,ZHOU Yun-zhi²,YAO Bin³,CHEN Ru-mei²,FAN Yun-liu²

1.College of Life Science, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
2.Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agicultural Sciences, Beijing 100081，China
3.Feed Research Institute, Chinese Academy of Agicultural Sciences, Beijing 100081, China

全文: PDF(816 KB) HTML

摘要：

为研究N-糖基化对黑曲霉Aspergillus niger 963植酸酶蛋白酶学性质的影响，利用Megaprimer PCR介导基因定点突变的技术，构建了植酸酶phyA2基因两个N-糖基化突变体，即将该基因编码蛋白质N87位和N102位的天冬酰胺密码子置换为编码与其具有相似结构的谷氨酰胺密码子，两个突变体分别命名为N87Q、N102Q,经测序结果比对和图谱分析，表明在核酸水平上成功实现了点突变，构建了酵母表达载体pPIC9-N87Q，pPIC9-N102Q，转化毕赤酵母GS115，经发酵罐水平诱导表达后，获得了N-糖基化缺失突变蛋白，对突变体蛋白在60℃进行处理发现，突变体N87Q处理1h后剩余50%的酶活， N102Q处理10min后酶活完全丧失，在37℃，不同的pH缓冲体系（pH 1～10）处理1h，N87Q剩余约大于70%的活性，而N102Q在pH＞8的环境下，没有检测到酶活。

关键词： 植酸酶; N-糖基化; 大引物PCR; 突变体

Abstract:

To study N-linked glycosylation of the phytase from Aspergillus niger 963 in the significance of its enzymatic properties, we constructed two N-glycosylation mutants by Megaprimer PCR-mediated gene site-directed mutagenesis techniques , Make the codon of N87 and N102-asparagine was replaced by the codon of glutamine. according to the location ,the two mutants were named N87Q、N102Q, sequencing alignment and analysis showed that site-directed mutagenesis was achieved in the nucleic acid level,we also constructed expression vector pPIC9-N87Q, pPIC9-N102Q,The recombinant protein were expressed in Pichia pastoris GS115 by fermentation,The N87Q retained more than 50% of its initial activity after incubation at 60℃ for 1h, while the activity of N102Q was lost completely after ten minutes,The N87Q retained more than 70% of its initial activity after being incubated under varying pH conditions (pH 1.0～10.0) at 37?C for 1h,however,The N102Q was not active above pH 8.0.

Key words: Phytase N-linked glycosylation Megaprimer PCR Mutants

收稿日期: 2010-03-10 出版日期: 2010-06-12

基金资助:

国家“973”计划资助项目(2005CB120905)

通讯作者: 陈茹梅 E-mail: rumei.chen@163.com

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引用本文:

殷亮杨文竹王新宇周蕴芝姚斌陈茹梅范云六. 黑曲霉Aspergillus niger 963植酸酶基因phyA2 N-糖基化突变体的构建与表达分析[J]. 中国生物工程杂志, 2010, 30(06): 54-59.

YAN Liang, YANG Wen-Zhu, WANG Xin-Yu, ZHOU Wen-Zhi, TAO Bin, CHEN Ru-Mei, FAN Yun-Liu. Construction and Expression Analyse of N-linked Glycosylation Site Mutants of phyA2 Gene from Aspergillus niger 963. China Biotechnology, 2010, 30(06): 54-59.

链接本文:

https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/Q789 或 https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/Y2010/V30/I06/54

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