目的:构建模型用于评估戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)突变衣壳蛋白与细胞的结合作用以及各氨基酸位点在细胞结合过程中的作用,探讨HEV的入侵机制,为研究HEV的受体奠定基础。方法:以D66的基因四型重组类病毒颗粒样抗原为研究对象,对其关键结构域位点的氨基酸进行定点突变,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法确认突变蛋白的正常构象,并通过流式细胞仪分析突变蛋白对吸附的影响,探讨影响病毒吸附入胞的关键位点。结果:通过聚合酶链式反应定点诱变技术成功制备并鉴定了45个正确折叠、构象正常的突变蛋白;ELISA检测结果显示,重组类病毒颗粒样抗原D66的单点突变并不会影响蛋白构象;应用模型模拟突变蛋白与细胞的结合过程,T484A、S488A、T489A、P491A、R512A、Y561A、N562A和T585A突变蛋白显著影响了对C3A的吸附。结论:成功建立了一种评估HEV衣壳蛋白与细胞结合性的模型,T484A、S488A、T489A、P491A、R512A等位点的丙氨酸突变显著减弱了HEV衣壳蛋白与细胞的结合,这些位点可能是影响HEV与细胞结合的关键位点。
目的:研究小鼠垂体瘤细胞(mouse pituitary tumor cell,AtT20)冷暴露后蛋白质甲基化的变化,以及高效富集和大规模鉴定AtT20细胞的甲基化肽。方法:使用胰蛋白酶和肽N-糖苷酶F(peptide N-glycosidase F,PNGase F)消化蛋白质,利用亲水相互作用色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)尖端富集甲基化肽,最后利用质谱法对甲基化肽进行整体分析;通过PhosphoSitePlus®数据库比对新的甲基化位点和蛋白,利用DAVID数据库进行GO功能富集和KEGG通路富集分析,最后对两组细胞所得的甲基化肽和甲基化位点进行差异分析。结果:共鉴定到55个甲基化蛋白和83个甲基化位点,其中78.3%的甲基化位点是未被报道过的;鉴定到的甲基化蛋白主要分布在核染色体、核小体和细胞核中,参与了基因沉默的调控、RNA剪接和mRNA加工等生物过程;KEGG通路富集表明这些蛋白与中性粒细胞胞外陷阱形成、酒精中毒和系统性红斑狼疮等相关。甲基化肽和甲基化位点差异分析显示有7条显著变化的甲基化肽和2个显著变化的位点。结论:AtT20细胞短期冷暴露后蛋白质甲基化变化不显著,首次对AtT20细胞进行全面甲基化蛋白质鉴定,发现了多个未被报道过的甲基化蛋白质和甲基化位点,以期为AtT20细胞的研究提供理论参考。
目的:研究类固醇受体共激活因子3(steroid receptor coactivator 3,SRC3)参与糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)肾功能紊乱及足细胞损伤的分子机制。方法:分析临床DKD肾活检样本SRC3的表达与足细胞损伤的相关性,并通过对C57BL/6及SRC3-/-小鼠注射链脲霉素(streptozotocin,STZ)诱导DKD疾病模型,检测空腹血糖、血清肌酐、血清尿素氮、24 h尿量、尿白蛋白肌酐比以评估肾功能,苏木精-伊红染色法、糖原染色法观察肾小球病理改变,透射电镜观察肾小球超微结构变化;免疫荧光染色及Western blot分析SRC3、足细胞标志物WT1、Podocin、Nephrin、凋亡相关蛋白Caspase3在DKD肾脏中的表达;酶联免疫吸附测定检测足细胞和系膜细胞上清液炎症因子TNF-α、IL-1β的水平。结果:STZ成功诱导了DKD小鼠模型,可以模拟DKD患者肾小球损伤;SRC3在DKD患者及小鼠肾脏中高表达,伴随足细胞标志物表达降低,提示SRC3蛋白表达水平与肾小球损伤程度呈正相关;小鼠敲除SRC3基因能够改善STZ诱导的小鼠肾功能紊乱,缓解足细胞损伤;体外实验也证实了沉默SRC3可缓解高糖环境刺激下足细胞的损伤;同时,敲降SRC3能够减少高糖环境下足细胞与系膜细胞炎症因子的产生。结论:SRC3蛋白在DKD患者、小鼠肾脏以及高糖环境的足细胞中高表达,证实了SRC3与DKD肾小球损伤呈正相关,进一步研究证实,在高糖刺激下SRC3蛋白高表达可促进足细胞与系膜细胞炎症因子产生。
目的:人工区室化是代谢工程及合成生物学的重要技术手段,针对脂滴区室化技术未得到有效评价的现状,以产油微生物红法夫酵母为检验体系,评价筛选脂滴定位信号。方法:基于芝麻油质蛋白oleosin的三维结构及其跨膜结构域分析,设计短序列脂滴定位信号,构建定位信号与eGFP荧光蛋白基因融合的表达载体,转化红法夫酵母,采用荧光显微观察评价定位信号的定位功能。结果:完整的oleosin蛋白Ols1(1-145)和肽段Ols2(1-63)、Ols4(32-63)、Ols5(44-63)均能引导eGFP定位于红法夫酵母的脂滴内部,肽段Ols3(64-145)不能有效引导eGFP定位于脂滴,仅在细胞质中游离表达。结论:筛选得到了一个短序列脂滴定位信号Ols5(44-63),其仅含19个氨基酸,能够有效引导eGFP定位于脂滴内部。
目的:改善重组人白介素-11在原核表达体系中的可溶表达水平以及在体内的循环半衰期。方法:通过构建白蛋白结合肽融合人白介素-11重组蛋白表达载体[pET-30a(+)-ABD-rhIL11],实现融合蛋白在原核表达体系中的可溶表达;基于疏水层析、离子交换层析和凝胶层析建立从破菌上清液中纯化ABD-rhIL-11的方法;通过圆二色光谱及荧光发射光谱分析等鉴定ABD-rhIL-11空间结构,并进行体内外活性及药效学评价。结果:成功获得纯度高于95%的重组融合蛋白,体外结合实验结果表明,ABD-rhIL-11能够迅速与人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)结合;细胞增殖实验结果显示,ABD-rhIL-11与对照品活性相当;药代动力学结果显示,融合蛋白能够显著延长白介素-11在大鼠体内的循环半衰期;血小板计数实验结果显示,ABD-rhIL-11能够有效刺激大鼠血小板增殖。结论:为基于白蛋白结合肽融合策略的白介素-11药物长效设计提供了新的思路。
目的:汞是一种广泛存在于环境中的剧毒污染物,在较低浓度就能对人体造成严重危害;基于T-Hg2+-T碱基错配原理构建生物传感器,实现对水体中Hg2+浓度的高灵敏、高选择性检测。方法:筛选富含胸腺嘧啶的寡核苷酸(thymine rich oligonucleotide,TRO)作为Hg2+特异识别探针,以核酸荧光染料Gelred作为荧光指示探针,构建Gelred/TRO生物传感器检测水体中Hg2+,并分析多种因素对检测体系的影响。结果:优化检测条件下,Gelred/TRO传感器对Hg2+检测的线性范围为10~800 nmol/L,线性方程为y=0.005 96x+0.881 44(r2=0.991 47),检出限为0.14 nmol/L;10种干扰离子(Fe2+、Co2+、Cu2+、K+、Mg2+、Ca2+、Ag+、Cl-、
蛋白组装技术发展迅速,被广泛应用于生物催化、生物传感器和药物释放等领域,已成为生物工程领域的重要组成部分。由于蛋白质-蛋白质相互作用的复杂性,以及对蛋白质折叠和分子识别的认识不够深入,设计复杂的蛋白组装非常具有挑战性。随着计算机技术和分子模拟的不断发展,已逐步实现了从原子和分子尺度精确设计蛋白质的组装体和预测蛋白组装体的结构,并进一步在蛋白组装体上设计催化位点来实现人工组装酶的生物催化。近年来,机器学习等人工智能技术已被应用到蛋白组装设计中并促进了蛋白组装研究的发展。综述计算模拟技术在蛋白组装设计、组装结构预测、催化位点设计等方面的研究进展以及在新酶设计、药物释放、生物传感器等方面的应用,以期通过基础理论研究指导面向更多不同应用领域的蛋白组装的设计和优化。
RNA结合蛋白在细胞中通过与RNA结合参与调控RNA的整个生命周期,在基因表达和生命进程中发挥着重要作用。RNA和蛋白质的结合异常与多种疾病的发生与发展密切相关,因此,探索RNA-蛋白质相互作用对研究潜在的生物功能和临床病理机制至关重要。近年来,随着鉴定技术的不断进步与革新,许多新的非经典RNA结合蛋白不断被发现。这些RNA结合蛋白大多数缺乏已知的RNA结合结构域,RNA与蛋白质之间复杂、多样的相互作用关系仍需进一步探究。从高通量鉴定和靶向鉴定两个方面,对基于质谱分析的RNA结合蛋白鉴定技术的最新进展进行综述,并着重讨论其技术原理、应用领域和优缺点,以期为更好地探索RNA-蛋白质相互作用的生物学功能及其在临床疾病中的作用机制提供参考。
对于表位疫苗的设计,通常是利用免疫信息学工具和相关技术方法对已获取或已知的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析,以此确定和预筛选出可能的优势表位,之后通过人工合成或基因工程技术等制备具有优势表位的多肽疫苗。免疫信息学的快速发展使其被成功应用于疫苗学领域,成为开发基于表位多肽疫苗最有效的方法。从免疫信息学在表位疫苗设计中的一般流程及疫苗验证、表位疫苗研发涉及的免疫信息学工具以及免疫信息学在表位疫苗设计中的具体应用等方面进行综述,以期为合理设计和研发有效的表位疫苗提供参考。
癌症的早期筛查和诊断是降低其发病率和死亡率的有效手段。乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤,其发病率已超过肺癌。随着电化学技术的革新,加之生物传感器具有灵敏度高、检测快速、操作简单、成本低等优势,电化学生物传感器被广泛应用于乳腺癌标志物的检测。对常见的乳腺癌靶标进行分类概述,以电化学相关的免疫传感器和适配体传感器为分类,对国内外关于电化学生物传感器在乳腺癌肿瘤标志物的应用研究进行总结和讨论,并对其发展前景进行展望。
纳米载药体系由于具有特殊的理化性质而被广泛应用于疾病治疗。然而,传统的合成纳米颗粒无法跨越天然屏障,且难以逃避免疫监视,因此在临床应用中副作用较大。仿生纳米颗粒由天然材料改造或以化学方法模仿生物结构的关键特征制备获得,在化学、物理或形态学上与生物学结构具有相似性,因此在惰性排斥、克服屏障和活性作用三方面表现出优异的智能化递送性能,可用于更加高效安全的药物递送。总结仿生纳米颗粒用于药物递送的设计原理,阐述四类仿生纳米载药体系的制备方法,归纳其应用于罕见病、神经退行性疾病、肿瘤、抗病毒疫苗研发和其他靶向治疗等领域的研究进展,并对该领域研究面临的应用挑战、潜在解决方案和未来研究方向进行展望。
丁烯基多杀菌素(butenyl-spinosyn)是一种由须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)产生的大环内酯类抗生素,属于绿色环保型生物农药,在防治害虫和粮食储藏方面具有很高的应用价值。野生型菌株产量较低,限制了丁烯基多杀菌素的应用,高产菌株的育种和发酵工艺优化是提升丁烯基多杀菌素产量的有效方法。对近年来遗传育种提高丁烯基多杀菌素的方法进行总结,分析须糖多孢菌的碳、氮、磷酸盐代谢通路改造及转录调控对丁烯基多杀菌产量的影响,展望异源表达进行菌株育种的前景,以期对丁烯基多杀菌素高产菌株的构建和优化提供有价值的参考。
