17α-羟基黄体酮(17α-OH-PROG)是甾体激素类药物的关键中间体,其生物合成主要由细胞色素单加氧酶(CYP17)催化生成。在此过程中,细胞色素 P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)作为细胞色素P450 酶电子传递链的重要组成部分,直接影响CYP17的催化效率。为研究不同来源CPR与17α-羟化酶的适配性,首先以人源17α-羟化酶作为研究对象,构建了表达质粒pPIC3.5k-hCYP17,获得了重组毕赤酵母菌株。其次筛选获得3种不同来源CPR,构建了表达质粒 pPICZX-CPR,获得17α-羟化酶与CPR共表达菌株,并在毕赤酵母中进行转化实验,对转化产物进行薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分析。结果显示,重组菌株具有17α-羟化酶活性,能够催化黄体酮生成目标产物17α-OH-PROG 以及副产物16α-羟基黄体酮(16α-OH-PROG)。不同来源的CPR与17α-羟化酶共表达与仅表达17α-羟化酶的产率相比均有所提高,其中hCPR-CYP17共表达菌株表现出最高的转化水平,17α-OH-PROG产率提高42%。上述结果表明:17α-羟化酶基因与CPR共表达能够提高其黄体酮17α-羟基化水平。为甾体黄体酮17α-羟基化的生物催化研究提供思路,对甾体药物的工业生产具有重要意义。
目的: WIND(WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION),是属于ERF/AP2 (ETHYLENE RESPONSE FACTOR/ APETALA 2)家族的一种重要转录因子,该类基因最早被发现在拟南芥中可以与乙烯响应元件GCC-BOX和脱水响应元件DRE结合,响应干旱信号和调节乙烯水平。最近的研究发现WIND基因在植物伤口信号回应、愈伤组织形成及不定芽的产生过程中也发挥了关键作用。已有的研究阐述了WIND基因在拟南芥中控制愈伤组织形成及不定芽再生的机制,但其在木本植物中的功能尚不明确,将探究WIND基因在胡杨中与伤口信号响应及不定芽再生相关的功能,同时为在分子水平上解决胡杨再生问题提供理论依据。方法: 采用基因克隆、qRT-PCR、转基因表型分析等方法研究WIND基因在胡杨外植体伤口响应和再生不定芽过程中的作用。结果: 克隆胡杨WIND家族中的基因PeWIND1和PeWIND2,发现其编码区序列长度分别为1 050 bp和1 032 bp,编码349个和343个氨基酸,亚细胞定位均在细胞核中。组织特异性分析显示PeWIND1和PeWIND2在胡杨根、茎、叶、愈伤组织中均有表达,且在愈伤组织中表达量最高。时间表达特异性显示,在经伤口刺激后的24 h内,PeWIND1和PeWIND2基因均呈现先升高后降低的表达趋势,且均在伤口刺激后1 h达到表达量峰值。转基因植株表型统计发现,过表达PeWIND1和PeWIND2基因后转基因植株不定芽再生能力增强。结论: 在胡杨叶片有伤口刺激后,PeWIND1和PeWIND2响应伤口信号,表达量先升高后降低,PeWIND1和PeWIND2能够促进杨树茎段再生不定芽。
通过吸附法将生物酶负载在γ-Al2O3小球载体上,并对生物酶/γ-Al2O3及载体进行扫描电镜(SEM)、比表面积分析(BET)、傅里叶红外光谱(FT-IR)及圆二色谱(CD)表征。结果表明:生物酶被吸附在载体上。将制备的生物酶/γ-Al2O3催化真实柴油氧化脱硫,考察了反应温度、反应流速和酶溶液浓度对真实柴油脱硫效果的影响,并对脱硫效果进行定性及定量分析;进一步对脱硫工艺条件进行响应面设计优化,找出最优反应条件。实验结果显示:反应温度49℃、反应流速1.0 mL/min、酶溶液浓度15.5%(酶载量为28.13 g),得出的最优脱硫率为93.16%;最后考察了该固定化酶的重复使用性能,该催化剂使用7次活性无明显降低,表明该固定化酶催化氧化柴油脱硫效果显著,具有潜在的工艺应用价值。
目的: 制备大鼠SUMO特异性蛋白酶1(sentrin-specific protease,SENP1)催化结构域(SENP1C)蛋白,并鉴定其酶活性。方法: 分别以大鼠SENP1-pcDNA3.1和EGFP-pcDNA3.1重组体为模板,PCR扩增目的基因,克隆入pGEM-T载体;酶切鉴定后,再亚克隆入原核表达载体pET-28a;阳性重组体导入原核表达细胞BL-21,异丙基硫半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达;SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色鉴定蛋白质的表达。Ni-NTA吸附纯化蛋白质并透析处理,SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色鉴定蛋白质的纯度;1 μmol/L及5 μmol/L Tat-EGFP分别孵育HT22细胞不同时间,荧光显微镜下观察细胞转染情况。采用5 μmol/L Tat-SENP1C预孵育HT22细胞10 h,免疫印迹检测整体蛋白质的SUMO化水平;用5 μmol/L Tat-SENP1C预孵育HT22细胞或过表达Myc-Akt1和HA-SUMO1的HT22细胞10 h后,免疫沉淀和免疫印迹检测内源性和外源性Akt1与SUMO1的结合(SUMO化)。结果: Tat-SENP1C-pET-28a和Tat-EGFP-pET-28a重组原核表达载体成功构建,IPTG可以诱导蛋白质高表达;采用Ni-NTA纯化和透析可获得较高纯度的蛋白质;5 μmol/L Tat-EGFP孵育HT22 细胞10 h后,蛋白质穿膜效率较高;Tat-SENP1C重组蛋白可以显著降低HT22细胞中整体蛋白质的SUMO化以及内源性和外源性Akt1 SUMO化。结论: Tat-SENP1C-pET-28a和Tat-EGFP-pET-28a重组原核表达载体构建成功,且被IPTG诱导后可高效表达蛋白质;纯化的Tat-SENP1C蛋白具有较强的穿膜能力及酶活性。
人体细胞、细菌、病毒等生命体可以改造为工程生物活药,可在患者体内维持生物活性、自我复制并表达基因。相比于传统药物,工程生物活药在体内维持疗效时间长,具备外源基因表达能力,可实现多功能性和稳态调控,且具有独特的靶向、响应等能力。近年来,工程生物活药在肿瘤免疫治疗中的应用受到广泛关注,CAR-T等细胞治疗、溶瘤病毒疗法已在临床中获得良好的疗效,工程菌也在临床和临床前研究中发展迅猛。细胞、细菌、病毒三类活药的特性和治疗机制不同,因此具有不同的设计目的与思路。随着合成生物学技术的发展,工程生物活药将更安全、更高效,也将为肿瘤治疗带来新的机遇。针对工程生物活药在肿瘤免疫治疗中应用的最新进展开展了综述,阐述了不同生物活药的合成生物学设计和免疫治疗机制。
基于信使RNA(messenger RNA, mRNA)的核酸疫苗是近年来兴起的一种mRNA技术。mRNA疫苗比传统疫苗有许多优点,能够实现快速、经济、高效的生产。单个mRNA疫苗可以编码多种抗原,增强对特定病原体的免疫反应,提高疾病的治疗效率,以单一配方针对多种病原微生物或疾病。mRNA疫苗相关技术在新型冠状病毒肺炎疫情防控中被视作一种革命性的疫苗技术,以创纪录的速度完成研发并成功应用。由于mRNA自身稳定性差,新型递送系统的开发与应用至关重要。随着mRNA相关药理学的深入研究,mRNA疫苗的临床应用进入了一个崭新的阶段。近年来。mRNA疫苗在传染性疾病预防、肿瘤治疗等方面获得充分发展并取得了一定的研究成果,对其进行概述并进行一定程度的展望。
双特异性抗体是一种可以同时结合两种靶点的抗体,与单特异性抗体相比具有疗效高、毒副作用小的优点,因此成为近年来的研究热点。但双特异性抗体是由两种不同的重链和轻链所组成,而且重、轻链的表达难以控制在同一水平,因此在双特异性抗体的组装过程中极易出现各种错配副产物,大大增加了下游纯化的难度与成本。近年来,多家制药公司研发出商业化的双特异性抗体制备平台,这些平台利用独特的分子设计策略极大提升了双特异性抗体的组装成功率。然而,各种双抗分子设计策略不足以完全避免副产物的产生,因此还需要配合各种层析方式来进一步去除双抗分子副产物以提升产品质量。综述了近年来几种主流双特异性抗体研发设计平台,系统归纳了用于去除同源二聚体、半抗体、3/4抗体及聚集体的层析方法,以期为双特异性抗体纯化提供理论依据。
骨髓间充质干细胞是具有多向分化能力的一种干细胞,近年来有关研究发现骨髓间充质干细胞分泌的外泌体具有促进损伤肌腱修复、血管生成、抑制氧化应激反应、保护神经细胞、促进软骨再生、调节骨代谢等功能。而激素性股骨头坏死是由于大量使用激素导致的股骨头无菌性坏死,其具体作用机制尚未阐明,相关信号通路,如Wnt/β-catenin、RANKL-RANK、PTEN/AKT、PI3K/AKT等通路在其中起着关键的作用,而这些信号通路的激活又与外泌体密切相关,综述了骨髓间充质干细胞来源外泌体及其相关信号通路在激素性股骨头坏死中作用的有关研究进展,以期对激素性股骨头坏死的防治及相关药物研发有一定指导意义。
芳香族化合物种类丰富,在多个行业具有广泛的用途,需求量大。通过构建微生物细胞工厂合成芳香族化合物具有独特的优势和工业化应用前景,其中酵母底盘因其清晰的遗传背景、完善的基因操作工具以及成熟的工业发酵体系等优势,常被用于构建细胞工厂。目前改造酵母底盘生产芳香族化合物的研究取得了一系列进展,并针对关键问题提出了一些可行的解决策略。针对酵母合成芳香族化合物的策略与挑战,从芳香族化合物合成路径改造、多样化碳源利用及转运系统改造、基因组多靶点改造、特殊酵母底盘及混菌系统构建、合成生物学高通量技术的应用这五个方面进行系统地梳理和阐述,为生产芳香族化合物的酵母底盘构建与改造提供思路。
随着绿色化学的兴起,天然纤维素原料转化和利用的研究受到了高度重视和广泛应用。利用纤维素酶降解纤维素为燃料乙醇、生物柴油的生产铺设了道路。但纤维素酶的生产成本较高,限制了纤维素酶产业化应用。里氏木霉生产的纤维素酶组分丰富,是纤维素酶高产菌株,深入研究里氏木霉的纤维素酶诱导及表达调控机制,有助于提高其纤维素酶产率。近年来人们对里氏木霉的纤维素酶诱导过程和调控机制有了一定研究进展,综述了里氏木霉纤维素酶诱导和基因表达调控,首先介绍了纤维素、纤维二糖、槐糖、乳糖等几种诱导物及诱导物的转运蛋白,进一步综述了几种转录因子的调控作用,同时介绍了染色体调控、信号通路和光条件对纤维素酶诱导的影响。最后展望了未来里氏木霉纤维素酶诱导表达的研究方向,包括探明诱导物的本质及其具体过程、揭示转录因子之间的联系及转录调控网络、寻找信号转导关键功能蛋白及研究环境因素对纤维素酶的诱导作用等。
体外诊断在疾病诊疗过程中扮演着非常重要的角色,素有“医生的眼睛”之称。新冠肺炎疫情让人们对生命健康的关注程度空前提高,在此背景下,体外诊断作为大健康产业的重要一环,迎来爆发式增长。概述全球和中国体外诊断行业发展现状,重点分析市场规模、竞争格局和国产化情况,分析现阶段我国体外诊断行业遇到的问题,并从突破原始性创新、加强资金保障、构建产业链生态、加大人才培养力度等方面提出建议和对策。
当前全球种业基本形成“两超、四强、差异化发展”新格局,种业巨头主导着全球作物育种技术研发和产业发展。通过深入分析和挖掘跨国种企作物育种专利,洞察其技术研发布局,为我国合理部署作物育种技术研发、改善知识产权布局与保护具有借鉴意义。基于Derwent Innovation(DI)专利数据库,以“两超四强”跨国种企2015~2019年申请的作物生物育种专利为研究对象,通过文本聚类法全面分析了“两超四强”跨国种企的生物育种研发布局,通过计量指标结合专家咨询遴选出其重点专利,厘清其技术研发重点。据此提出我国应当瞄准生物育种核心领域加强新兴前沿技术原始创新与集成开发,加强新型抗虫基因挖掘与抗虫新机制研发,强化生物育种核心技术链、产业链知识产权协同保护与布局,提升知识产权保护水平及全球化结合重点布局的知识产权战略意识的建议。
病毒是危害人体健康的主要病原体之一,病毒感染和传播造成的传染性疾病严重威胁人类健康。目前,艾滋病、病毒性肝炎等发病率高、治愈率低的病毒性疾病仍在全球蔓延,流感病毒、冠状病毒等呼吸道病毒不断发生变异,2019年以来,新冠病毒引起的全球疫情对世界各国产生巨大影响,疫情走向还存在很大不确定性,开发安全有效的抗病毒药物成为应对病毒性疾病的重要手段。拟在总结全球抗病毒药物研发整体现状的基础上,分析抗艾滋病病毒、肝炎病毒、新冠病毒等重点领域的新药研发进展,提出抗病毒药物的发展建议,为未来研发更加高效的抗病毒药物提供指引和参考。
