目的 利用生物信息学软件评价幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)多价表位疫苗CWAE的抗原结构,经原核表达获得高纯度CWAE蛋白,进而鉴定多价表位疫苗CWAE的免疫学性质。方法 通过生物信息学软件分析H. pylori多价表位疫苗CWAE的抗原结构;用人工合成的H. pylori多价表位肽融合基因WAE替换重组质粒pET28a-CUE中的UE基因,构建重组质粒pET28a-CWAE。然后,将pET28a-CWAE转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,并通过Ni-NTP镍离子亲和层析纯化抗原蛋白CWAE;利用GM1-ELISA鉴定CWAE中CTB组分的黏膜免疫佐剂活性。最后,通过ELISA和小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验检测CWAE激发BALB/c小鼠产生抗H. pylori抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答的能力。结果 通过生物信息学软件证实H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的结构;重组表达质粒pET28a-CWAE经PCR、双酶切和基因测序鉴定,融合基因CWAE与设计序列完全一致;重组基因工程菌株pET28a-CWAE/BL21(DE3)经IPTG诱导表达,抗原蛋白CWAE主要以包涵体形式存在,经Ni-NTP镍离子亲和层析纯化,纯度约达93.2%;GM1-ELISA实验证实,CWAE中CTB组分依旧保持有较好的黏膜佐剂活性;ELISA结果证实CWAE能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体,而小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验进一步证实CWAE能够激发针对H. pylori多种致病因子的淋巴细胞免疫反应。结论 H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的抗原结构,经原核表达可获得高纯度抗原蛋白,能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答。为研发防治H. pylori感染的多价表位疫苗奠定实验基础。
目的 探索更有效的肺炎链球菌DNA疫苗和疫苗免疫策略,并探究其中的保护机制。方法 构建重组质粒pcDNA3-dnaJ并表达DnaJ蛋白,实验分别设置重组质粒pcDNA3-dnaJ/蛋白DnaJ免疫小鼠组及单独质粒pcDNA3-dnaJ免疫小鼠组,分别比较肺炎链球菌菌株攻毒后小鼠鼻腔灌洗液细菌载量及生存率,采用ELISA检测免疫小鼠血清抗体效价及炎症因子,流式细胞术分析体外BMDCs激活情况及Th1和Th17细胞免疫应答。结果 质粒pcDNA3-dnaJ免疫3次可诱导血清中抗原特异性抗体的产生,并减少肺炎链球菌攻毒后鼻咽部的细菌载量,但在防止致死性感染方面效果较差。然而,与重复质粒DNA接种三次相比,pcDNA3-dnaJ 1次/ DnaJ蛋白加强1次的免疫策略可以显著减少鼻咽中的肺炎链球菌定植,并能够更好的预防致死性感染。此外,与DNA质粒加强免疫相比,DnaJ蛋白加强免疫后可产生更高水平的IFN-γ和IL-17A。结论 重组质粒pcDNA3-dnaJ/蛋白DnaJ异源免疫可能通过活化树突状细胞,进而诱导Th1和Th17细胞免疫应答,抵抗肺炎链球菌感染。
拉沙病毒和马秋波病毒同属于沙粒病毒科,人类感染后病死率很高,对人类生命健康造成了严重威胁。沙粒病毒在基因组转录过程中存在与其他分节段负链RNA病毒相似的抢帽机制,位于病毒聚合酶N端的核酸内切酶结构域负责切割宿主mRNA,而其C端负责结合宿主mRNA帽子。目前对哺乳动物沙粒病毒聚合酶C端的特征知之甚少。为此构建了拉沙病毒和马秋波病毒聚合酶C端的重组表达载体,并利用E.coli原核系统进行表达和后续纯化,获得了不同聚体形式的C端蛋白,通过分析超速离心实验和负染电镜观察对其不同的聚体形式进行了表征。最后通过大量筛选结晶条件,得到了拉沙病毒聚合酶C端的晶体,为进一步研究其三维结构和功能机制奠定了基础。
羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶 (NmLEH) 通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21(DE3) 宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0.5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高 (0.45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组NmLEH蛋白;对NmLEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH 为7.5,在pH 7.0~9.0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明NmLEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。
目的 改进伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)的注射方法,通过溴化乙锭(ethidium bromide,EB)诱导的短暂脱髓鞘提高PRV的转导效率。方法 选用18只正常成年Wistar大鼠,随机分为肌肉组、NS组和EB组(n=6)。肌肉组将2μl滴度为2×10 9的PRV工具病毒注射到胫骨前肌和腓肠肌上;NS组将2μl生理盐水(normal saline,NS)注射到坐骨神经上,1周后相同位置注射2μl滴度为2×10 9的PRV;EB组将2μl 0.1%的EB注射到坐骨神经上,1周后相同位置注射2μl滴度为2×10 9的PRV。大鼠注射PRV 5天后,灌流取材并制作冰冻切片,观察各级神经元的感染情况。 结果 EB组大鼠L4-L5脊髓前角神经元和背根神经节(DRG)、T8脊髓中间神经元、C4脊髓中间神经元、延髓、中脑、大脑皮层均有大量神经元被PRV标记。肌肉组和NS组各级神经元仅有少量被PRV标记。结论 EB诱导坐骨神经脱髓鞘后能够显著提高PRV的逆行转导效率。
目的 程序性死亡配体-1(PD-L1)是免疫调节途径的重要因子,是抗肿瘤免疫疗法中重要的靶标之一。利用CRISPR/Cas9技术成功构建PD-L1基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型。方法 构建Cas9和sgRNA载体,并转录获得RNA,通过显微注射方式将RNA注射到C57BL/6小鼠受精卵中,经过鉴定获得F0代阳性小鼠。F0代小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配获得F1代杂合子小鼠,再通过F1代小鼠自交获得F2代纯合子小鼠品系。随后通过Real-Time PCR和流式实验分别检测PD-L1基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。结果 Real-Time PCR和流式实验检测结果显示与野生型C57小鼠相比,PD-L1纯合子小鼠的PD-L1 mRNA相对表达水平和细胞上的蛋白质表达均有显著性下降,仅测定到本底的信号,证实已成功构建PD-L1基因敲除小鼠品系,为PD-L1体内基因功能研究提供了新的小鼠模型。
如何将生物活性分子高效投递到靶标的细胞和组织仍然是生物治疗领域研究人员面临的难题之一。直到细胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPPs)的出现,其可介导多种外源性功能分子(核酸、多肽、蛋白质和化学药物)进入细胞,而且不影响外源活性分子的功能发挥。另外,CPPs在传递外源活性成分进入肿瘤组织和细胞方面表现出更具应用前景的优势。因此,通过对CPPs的分类、鉴定方法、穿膜机制、其在抗肿瘤治疗中的最新应用以及尚需要解决的问题进行综述,以期为新型CPPs的鉴定和其抗肿瘤治疗策略提供参考。
细胞自噬是细胞在应激条件下降解胞内受损成分的过程,涉及多信号分子参与。在疾病发生、发展过程中,细胞自噬既可抑制或延缓疾病发展,还可使病情恶化,故寻找在不同阶段调控细胞自噬作用的因子探究其有效作用靶点具有重要意义。非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)是从基因组中转录出来的不行使编码蛋白质作用的一类RNA的总称。进几年来,越来越多不同ncRNA被发现,并在动物机体生理和病理过程中发挥着重要的调控作用。已有研究表明,ncRNA在细胞自噬发生过程起到重要的调控作用。从微小RNA(MicroRNA,miRNA)、长链非编码RNA(Long noncoding RNAs,lncRNA)、环状RNA(CircularRNA,circRNA)几方面综述了ncRNA在细胞自噬通路中的调节作用,为癌症等疾病治疗以及分子标记提供理论指导和新思路。
溶酶体-自噬系统在细胞对纳米材料的适应性反应中起到关键作用。自噬在保护细胞免受损伤和保持细胞稳定方面发挥重大作用,但纳米材料引起自噬的本质尚不清楚。纳米材料被细胞认为是外来入侵者,其积累将激活机体的清除机制,引发自噬。介绍了纳米材料诱导自噬发生的自我保护机制,综合分析了纳米材料对溶酶体-自噬系统的影响及其生物学效应。
趋磁细菌是一类可以沿磁场方向进行运动的微生物统称,在细胞内合成由生物膜包被、链状排列、纳米级、单磁畴的磁铁矿 (Fe3O4) 或胶黄铁矿 (Fe3S4) 的磁小体颗粒。趋磁细菌在自然界分布广泛且多样性丰富,不仅在水环境和沉积环境的铁、硫、碳、氮、磷等元素生物地球化学循环中发挥重要作用,而且在污染治理、疾病诊断和治疗等方面有较好的应用。趋磁细菌磁小体由生物膜包被并在细胞调控下合成,是一类新型的生物源磁性纳米材料。相比常规化学合成的磁性纳米颗粒,磁小体具有大小均一、生物相容性高、兼具化学修饰和基因工程修饰功能等特点,在磁性分离、固定化酶、食品检测、环境监测、医学诊断、磁共振成像、磁热疗和靶向治疗等方面具有广阔的应用前景。在介绍趋磁细菌多样性研究的基础上,综述了趋磁细菌和磁小体的制备、修饰及其应用的最新进展,并对未来的研究进行了展望。
转基因玉米是当前全球第二大转基因作物,在保障人类能源、饲料、工业等方面发挥着重要作用。基于智慧芽数据库(PatSnap)对欧盟、美国及中国等国家或地区收录的1985~2018年全球转基因玉米技术领域专利文献进行统计分析,得出全球转基因玉米专利技术发展的总体趋势、技术分布与格局及研发热点,并对比分析了国内外主要研发单位转基因玉米研发的竞争力,对未来转基因玉米的产业发展提出了展望。
近几年全球生物类似药发展如火如荼,各国出台积极政策响应与推动生物类似药的研发和应用,大型制药企业也通过一系列对生物医药公司的收购完成生物类似药研发先机的抢占。以Pfizer vs. Johnson案为研究对象,对美国生物类似药的保障政策、诉讼案件发展和系列焦点问题进行整体描述与深入分析。研究发现,来自原研企业的竞争压力及临床对生物类似药可替代性的质疑与保守态度,都在一定程度上对类似药的应用和推广构成威胁,而其价格优势和越来越明朗的政策环境使得生物类似药的未来可期。
生物医药产业是各大经济体在21世纪优先发展的战略性产业,并逐步成为世界经济的主导产业。我国制定了一系列鼓励政策加快推动生物医药创新发展,为我国生物医药创新打造了良好的大环境。在大众创业、万众创新的大背景下,各地相应建设生物技术科技园和孵化器,促进生物技术企业创新。通过阐述生物产业最为发达的国家——美国不同类型的生物技术孵化器的建设、运营、孵化成功案例等,分析了孵化器内部运营与外部协作的生态关系,总结了孵化器孵化成功的经验,针对我国生物技术孵化器的建立和运营提出了建议。
