目的:在毕赤酵母SMD1168中表达融合抗菌肽,并检测其体外抑菌活性。方法:本实验从实验室先前构建的重组质粒pVAX1-RHKJT中克隆出已构建好的融合抗菌肽RHKJT基因片段,将RHKJT基因片段插入至pGAPZaA真核表达质粒中,通过PCR和测序验证,构建pGAPZα-RHKJT重组真核表达质粒,将线性化的pGAPZα-RHKJT电转化至毕赤酵母SMD1168中获得重组酵母SMDpG-RHKJT,并通过PCR和RT-PCR验证,对重组毕赤酵母SMDpG-RHKJT进行发酵,并收集发酵上清液进行体外生物活性测定。结果: 成功获得重组酵母SMDpG-RHKJT菌株,重组酵母发酵上清液对大肠杆菌标准菌、大肠杆菌耐药菌、沙门氏菌标准菌、金黄色葡萄球菌标准菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、肺炎链球菌标准菌均具有显著的抑菌活性。结论:重组酵母表达的融合抗菌肽具有较广的抗菌谱和较高的抑菌活性,具有良好的潜在应用前景。
木霉菌(Trichoderma spp.)是一种广泛存在于土壤及植物根系生境中的丝状真菌,具有拮抗植物病原真菌和促进植物生长的双重功效。碳代谢抑制子CRE1全局性调控细胞生长代谢过程,保障木霉在不同生境中的存活及拮抗病原菌特性。比较深绿木霉(T.atroviride)T23及其Cre1突变株(T23Δcre1)在不同培养基中的生长和代谢特性,结果表明:cre1基因沉默后,T23Δcre1较T23菌丝生长变慢,产孢滞后且降低一个数量级,cre1对菌丝生长和产孢的调控依赖于培养基组分。此外,cre1基因抑制几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶基因转录,区别性调控部分次级代谢合成的非核糖体肽合成酶NRPS和聚酮合成酶PKS基因的表达。综上,碳代谢因子CRE1作为一个多效性的转录调控因子,抑制细胞壁降解酶和代谢产物合成相关的基因表达,赋予木霉菌在环境中的适应性和竞争性,是深绿木霉T23生长的必要因子。
糖基转移酶Alg11作为N-糖基化途径中一个重要蛋白,功能为催化将甘露糖转移到底物DPGn2M3(Dolichyl-pyrophosphate-GlcNAc2Mannose3)上进而生成DPGn2M4和DPGn2M5这两种多萜醇寡糖前体的反应。在本研究中,首先通过对酿酒酵母Alg11的蛋白质结构进行分析,设计了去除跨膜域的蛋白Alg1145-548并成功在大肠杆菌中表达,进而对诱导时间、诱导剂浓度进行了产量最大化的优化,最终得到了纯化蛋白。以PPGn2(Phytanyl-pyrophosphate-GlcNAc2)为底物,利用体外表达的重组蛋白Alg1ΔTM和Trx-Alg2以酶法合成出Alg11的天然底物类似物PPGn2M3。用纯化的Alg1145-548蛋白催化转糖基反应,并通过液质联用(LC-MS)的方法检测产物,证实Alg1145-548蛋白具有催化PPGn2M3生成PPGn2M4和PPGn2M5的糖基转移酶活性。产物PPGn2M5通过不同的甘露糖苷酶酶切反应,验证了两个新加上的甘露糖以α-1,2糖苷键的形式连接到底物PPGn2M3上。底物特异性实验表明Alg1145-548可以特异性识别底物PPGn2M3,而其他N-糖基化中间体类似物如PPGn2和PPGn2M1无法被识别,且底物中的脂肪链结构也对酶的识别具有重要作用。Alg11的底物特异性保证了多萜醇寡糖前体的有序合成,具有重要的生理意义。
胆固醇氧化酶专一性催化胆固醇为胆甾-4-烯-3-酮,广泛的应用于临床以及食品加工行业。本论文将来源于Pimelobacter simplex的胆固醇氧化酶PsCO4,分别转化到大肠杆菌宿主BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和C41(DE3)中,在不同温度(15℃、25℃、37℃)及IPTG诱导浓度(0.01mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L)下异源表达PsCO4。结果表明,转入Rosetta(DE3)菌株的PsCO4蛋白,在IPTG浓度为0.1mmol/L、15℃下经18h诱导表达,PsCO4可溶性表达量最高(0.63mg/ml)。异源表达的胆固醇氧化酶PsCO4最适温度为30℃,最适pH为7.5。通过TLC, GC-MS检测出PsCO4催化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮。以胆固醇和β-谷甾醇、豆甾醇和孕烯醇酮为底物,测定PsCO4对四种底物的催化反应动力学参数,胆固醇kcat/Km为0.08s -1·μM -1分别高于β-谷甾醇(0.04s -1·μM -1)、豆甾醇(0.005s -1·μM -1)和孕烯醇酮(0.02s -1·μM -1)。
目的:研究pH调控对发酵法生产环β-1,2-葡聚糖的影响,并对pH调控条件下所产环葡聚糖的结构进行解析。方法:以根瘤菌ATCC 1333为研究对象,进行pH调控与不调控的发酵过程分析,并结合乙醇分级沉淀对pH调控后的发酵液中多糖进行分离提纯,经Superose 12层析纯化,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-MS)、单糖组成分析、电喷雾串联质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS),傅里叶红外光谱(fourier transform infrared spectoscopy, FTIR),核磁共振nuclear magnetic resonance, NMR)手段对葡聚糖进行结构鉴定。结果:提出两阶段pH调控发酵策略,生长期pH控制为7.0,产糖期pH控制为5.5,与自然发酵模式相比,环葡聚糖产量增加了52%,细胞浓度增加了102%,并且发酵颜色不再发生褐化现象,更有利于后续环葡聚糖的分离纯化。并确定pH调控对根瘤菌ATCC 1333发酵生产的葡聚糖的结构并无影响,合成的环葡聚糖是以葡萄糖为单体,通过β-1,2糖苷键连接的环葡聚糖,聚合度从17~22,以19为主的环状葡聚糖,无支链结构。结论:pH调控对于发酵生产环β-1,2-葡聚糖的结构无影响,为环β-1,2-葡聚糖的发酵工艺研究提供理论基础,也为研究β-1,2-葡聚糖提供可靠的糖源。
目的:应用CRISPR/Cas9技术构建去泛素化酶YOD1基因敲除小鼠。方法:针对YOD1基因设计单链向导RNA(sgRNA)识别序列,构建sgRNA质粒,与Cas9质粒体外转录、纯化后注射入受精卵,通过PCR和测序验证得到F0代阳性小鼠。配繁两代后,取同窝对照的野生型(WT)和敲除(KO)小鼠的主要组织器官研磨,使用免疫印迹(WB)技术检测各组织YOD1蛋白的表达,确证YOD1敲除小鼠模型是否成功建立。统计YOD1杂合子(HET)自交存活后代各基因型比例,分析是否有胚胎致死表型。解剖小鼠分析主要组织器官的表型,进一步利用H.E.染色分析KO小鼠是否存在自发的病理改变。通过血糖耐受实验(GTT)分析KO小鼠的血糖调控能力。结果:基因组测序和WB检测结果显示KO小鼠中YOD1被明显敲除,YOD1敲除小鼠模型成功建立。YOD1杂合子自交后代各基因型比例符合孟德尔定律,提示KO小鼠非胚胎致死。YOD1敲除小鼠肝脏显著小于WT小鼠。GTT结果表明敲除YOD1不影响小鼠的血糖稳态。结论:应用CRISPR/Cas9技术成功构建YOD1基因敲除小鼠。KO小鼠正常出生,无任何胚胎发育缺陷。与WT小鼠相比,KO小鼠肝脏显著减小,但无显著的自发病理变化,KO小鼠血糖控制亦无显著差异。
目的:为了制备可追踪CD133阳性神经干细胞分化谱系的小鼠模型。方法:将两种C57B16背景的转基因小鼠CD133-Cre-ERT2和Rosa26-CAG-LSL-ZsGreen杂交,获得CD133-CreER;CAG-ZsGreen小鼠模型。结果:免疫组化和激光扫描共焦成像分析表明,经Tamoxifen作用后,该杂交小鼠在侧脑室SVZ区、第三脑室和第四脑室的室管膜区域均表达绿色荧光蛋白ZsGreen,且这些区域的绿色荧光与CD133+红色荧光重合。 结论:在室管膜区CD133+是静息态神经干细胞的标志,因此,通过分析CD133-CreER;CAG-ZsGreen小鼠中的 ZsGreen阳性细胞可追踪神经干细胞的细胞分化谱系。成功制备了内源CD133+细胞示踪小鼠模型,为探讨大脑中CD133+神经干细胞的激活、增殖、迁移和分化提供了帮助。
Sp2/0是一种生产单克隆抗体的常用细胞株。本研究首先在批次培养模式中对适合Sp2/0细胞生长的5种基础培养基、摇床转速、培养温度、二氧化碳浓度、微量元素和GlutaMAX TM替换谷氨酰胺等影响因素进行了筛选研究。结果显示Sp2/0细胞在批次培养中细胞密度最高值达到13.12×10 6 cells/ml,培养时间为7天。除培养温度会导致不同的细胞生长密度和活率、进而影响培养时间外,其它因素不能导致明显的细胞生长差异。随后在流加培养模式下就14种补料组合进行了筛选,Sp2/0在流加培养模式下细胞的峰值密度可达20~30×10 6 cells/ml,培养时间9天,单克隆抗体Mab-A日产量最高达到27.20mg/L。最后应用批次-反复流加培养模式培养Sp2/0细胞,该条件下峰值细胞数为50.42×10 6 cells/ml,培养时间14天,每天单抗产量(141.10mg/L)是流加培养的5.19倍。这些研究结果为Sp2/0细胞规模化生产单克隆抗体奠定了一定基础。
葡萄糖及脂肪酸是胰岛β细胞的关键代谢底物,葡萄糖刺激胰岛β细胞分泌胰岛素是维持机体血糖稳态平衡的关键。胰岛素抵抗发生时,β细胞对能量代谢底物的选择失调,加速胰岛β细胞由代偿到胰岛β细胞失代偿的进程,是肥胖胰岛素抵抗最终发展为2型糖尿病的始动因素。核转录因子FoxO1属于Fox家族成员,在胰腺内广泛表达,在β细胞的代谢,发育,增殖过程中发挥着重要的调节作用。鉴于FoxO1在维持胰岛β细胞功能中的关键作用,现着重对FoxO1在胰岛β细胞代谢灵活性受损及失代偿过程发生中的作用调节进行阐述。为其作为调控胰岛β细胞功能的关键靶点提供参考。
铁蛋白是一种普遍存在于生物体内的储铁蛋白,具有铁离子代谢、抗氧化胁迫及消除其他过量金属离子毒害作用的功能。随着对铁蛋白结构和生化功能认识的深入,铁蛋白作为一个含有四氧化三铁核心的特殊蛋白复合体,被广泛应用于生物医学、纳米材料、生物分子成像等各种生物工程领域。该综述针对已知的主要铁蛋白分子,论述了铁蛋白的结构及酶活性机理,基于铁蛋白的多功能分子骨架应用,以及基于铁蛋白磁性的生物分子开关等热点研究,最后对铁蛋白生物工程、生物医学领域的应用和发展进行了展望。
细菌脂蛋白是细胞膜的重要组成部分,对细菌发挥各种生理活性起重要作用,与营养摄取、环境感知、细胞膜和细胞壁稳态的维持、蛋白质的折叠和定位等过程密切相关。随着生物技术不断发展和完善,越来越多的脂蛋白种类及功能被发现。综述了革兰氏阳性菌中脂蛋白的功能、生物合成过程和应用方面的研究进展,重点介绍了脂蛋白生物合成过程中关键酶磷脂酰甘油转移酶(Lipoprotein diacylglyceryl transferase,Lgt)和脂蛋白信号肽酶(Lipoprotein signal peptidase II,LspA)对革兰氏阳性菌生理活性产生的影响,为今后革兰氏阳性菌脂蛋白的研究提出了展望和建议。
欧盟在风险预防方面一直走在世界的前列,其对于转基因生物的法律监管一直奉行的是预防原则。在该原则的指导下,欧盟建立起了极为严苛的转基因生物监管法律框架,并将该原则适用于转基因生物监管的各个环节。囿于预防原则的抽象性、模糊性等缺陷,该原则在欧盟转基因生物监管中的适用引发了成员国滥用保护性措施、国际贸易摩擦加剧等问题以致陷入困境。通过欧盟法院的判例与解释、相关法案的修正等措施,欧盟试图摆脱困境,使得预防原则在转基因生物的监管中起到更加有效的作用。我国对于预防原则存在与欧盟类似的理解与运用,现有法律框架对于转基因生物的监管亦过于严苛。借鉴国外经验,立足本土需要,当前应在充分认识预防原则的基础上,重新审视科学与法律的关系,适度放松转基因生物的法律监管。
为了研究纤维素预处理技术成熟度情况,基于多源文献数据利用Fisher-Pry模型对蒸汽爆破法、酸处理法、碱处理法和生物法等主要预处理技术成熟度进行了研究。结果表明,蒸汽爆破法、酸预处理法及碱预处理法从2005年之后快速发展,目前基本处于成熟阶段,但由于这些方法本身存在水解产生抑制性产物、腐蚀性、成本高等缺陷,很难取得进一步的突破。生物法目前还正处于快速成长阶段,具有很大的前景,经过Fisher-Pry曲线拟合,预计生物法到2043年左右达到成熟。
