目的:在不影响细胞活力的前提下,通过抑制人肿瘤坏死因子受体-Fc(TNFR-Fc)融合蛋白的降解,提高其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的产量和质量. 方法:通过在细胞培养过程中加入全蛋白质合成抑制剂Cycloheximide、溶酶体抑制剂Leupeptin、蛋白酶体抑制剂MG-132,验证TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞的降解途径;免疫印迹(Western blot)方法检测在细胞内TNFR-Fc融合蛋白的变化,酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测分泌表达的TNFR-Fc融合蛋白的含量.Protein A亲和层析纯化细胞培养液上清,高效液相色谱(HPLC)检测重组蛋白的纯度,并通过阻断肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的L929细胞毒作用来检测纯化的TNFR-Fc蛋白的活性.结果:TNFR-Fc在CHO细胞内,经泛素蛋白酶体途径降解,稳定表达TNFR-Fc的CHO细胞培养过程中添加50μmol/L MG-132,可以使TNFR-Fc融合蛋白的分泌表达量提高42.35%,纯化后,二聚体比例提高28.60%,并且纯化后目的蛋白的比活性也增加.结论:在不影响细胞活力、蛋白质生物学活性的前提下,添加蛋白酶体抑制剂MG-132提高TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达量,为进一步研究从抑制蛋白质降解途径来提高重组蛋白在CHO细胞中的表达量提供了现实依据.
目的:以Toll样受体拮抗物PolyI:C协同细胞因子IL-15作为免疫佐剂,通过滴鼻方式免疫ICR小鼠,对卵透明带3(murine zona pellucida,mZP3)基因疫苗的免疫增强效果进行观察.方法:将PolyI:C和IL-15单独或协同与用壳聚糖(chitosan,Chi)包裹的 mZP3 基因疫苗滴鼻免疫ICR小鼠,ELISA法检测小鼠血清中特异性抗mZP3抗体和生殖道黏液、肺洗液中sIgA的水平,MTT法检测淋巴细胞增殖,小鼠的平均窝仔数和生育率检测抗生育情况,组织学观察小鼠的卵巢病理切片.结果:PolyI:C协同IL-15共同免疫组能够显著提高免疫后小鼠抗mZP3抗体的水平,促进淋巴细胞的增殖,平均窝仔数和生育率显著降低,小鼠的卵巢发育异常.结论:PolyI:C协同IL-15能够增强 mZP3 基因疫苗的免疫效果,并在一定程度上降低小鼠生育率.
根据植物偏爱密码子优化设计、合成纳豆激酶基因sNK,利用重叠延伸PCR 法在其中插入番茄果实特异性表达基因 E8 的第一内含子构成sNKi基因,通过农杆菌渗透法将这两种基因渗入到烟草NC89 叶片中并实现瞬时表达.通过RT-qPCR 法将两种基因在烟草叶片中转录水平的表达量进行比较,结果表明两种基因在烟草叶片中均表达,且sNKi基因的表达量显著高于sNK基因;通过纤维蛋白平板法在两种基因的瞬时表达样品中均能检测到纤溶酶活性,表明目的基因在烟草叶片中可正常翻译并表现出溶栓活性,且sNKi基因在翻译水平的表达量显著高于sNK基因.表明内含子对人工合成的纳豆激酶基因的瞬时表达具有显著的促进作用.
目的:克隆向日葵中的ACC氧化酶基因( HaACO1),并对其进行生物信息学分析及盐胁迫表达分析,为理解向日葵ACC氧化酶生理功能并加强对ACO基因的利用奠定基础.方法:以前期从盐胁迫的内葵杂4号根中获得的ACC氧化酶基因片段4-4-7TDF(KM823963)为基础,通过RT-PCR和5'/3'RACE 技术克隆ACO基因的全长cDNA序列,利用生物信息学软件对获得的cDNA序列及编码的蛋白质序列进行分析.同时采用PCR方法克隆基因组DNA(genemic DNA,gDNA)序列,并对其进行结构分析.利用实时荧光定量PCR分析NaCl胁迫下向日葵根、下胚轴、叶中 HaACO1 的表达量和不同NaCl浓度及不同胁迫时间下根中 HaACO1的表达量.结果:HaACO1 的cDNA序列全长为1135bp,其开放阅读框为942bp,编码313个氨基酸.预测其分子质量和等电点分别为35.84kDa和5.13,基因登录号为KP966508. HaACO1 与已报道的多种植物的ACO基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列有较高的相似性,分别为76%~83%和77%~88%.gDNA起始密码子至终止密码子序列长1018bp,包含2个外显子和1个内含子,基因登录号为KP988289.实时荧光定量PCR分析表明向日葵 HaACO1 在不同器官及不同NaCl浓度、不同时间诱导下存在特异性表达差异.结论:获得的向日葵 HaACO1 是植物ACO家族成员之一,该基因应答盐胁迫具有独特的表达模式.
旁支代谢途径的截断有利于目的氨基酸合成途径的集流.基于基因组尺度代谢网络模型的预测,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT-M4为出发菌株,通过无痕敲除技术分别敲除了编码磷酸乙酰基转移酶的pta基因及编码乙酸激酶的ack基因,阻断了乙酸的合成.摇瓶发酵结果表明,pta缺失菌株精氨酸产量较出发菌株提高了25.60%,达15.46g/L.葡萄糖转化率提高了29.41%;ack缺失菌株精氨酸产量达13.82g/L,较出发菌株提高了12.81%,葡萄糖转化率提高了26.02%.同时,pta及ack敲除菌株的细胞生长较出发菌株均分别提高了9.19%及7.71%.因此,pta、ack的敲除不仅有利于精氨酸的合成,而且对菌体生长具有促进作用;但pta的敲除更有利于精氨酸的积累.
目的:构建黄病毒检测工程细胞系并对其功能进行鉴定.方法:以含有登革4型病毒814669株全长感染性克隆的质粒P4质粒为基础,缺失prM-E基因1 945bp,构建含有红色荧光蛋白mCherry报告基因的登革病毒复制子载体P4-△prME-mCherry.以P4-△prME-mCherry为基础,通过融合PCR方法,以真核表达载体pCDNA3.1+为骨架,构建用于黄病毒检测细胞筛选的缺陷型真核表达质粒pCDNA3.1-P4-mCherry.脂质体转染法将质粒pCDNA3.1-P4-mCherry转染BHK-21细胞,G418进行筛选,获得的阳性细胞克隆经96孔板系列稀释筛选、纯化克隆细胞BHK-Flavivirus.结果:BHK-Flavivirus细胞感染登革病毒60h后,能够在荧光显微镜下检测到红色荧光蛋白mCherry的表达,说明BHK-Flavivirus能够用于外源黄病毒的检测.BHK-Flavivirus细胞分别感染黄病毒属的乙脑病毒(P3)、4型登革病毒(P4),可以检测到红色荧光;而辛德毕斯病毒(XJ-160)、和基孔肯雅病毒(SD08Pan)、盖塔病毒(HB0234)等正链RNA病毒感染后则不出现红色荧光.结论:以上结果表明BHK-Alphavirus细胞可用于未知蚊媒黄病毒检测,该方法通过报告基因表达与否,能够高效、特异的甄别主要蚊媒甲病毒和黄病毒,同时该方法有利于稀缺病毒的分离、保存,操作方法简单、直观,有望应用于临床检测及病毒性生物战剂的早期甄别.
枯草芽孢杆菌具有良好的安全性和优异的外分泌能力,是目前常用的脂肪酶异源分泌表达体系.在枯草体系中如何提高脂肪酶分泌量是目前的研究热点.该体系中信号肽与目的基因不匹配和目标蛋白总表达量不高是导致脂肪酶LipS分泌表达效果较差的重要原因.针对这些问题,依据信号肽结构特征的不同(正电荷与疏水氨基酸个数的差异)对枯草芽孢杆菌体系中Sec和Tat这两个主要分泌途径的信号肽进行了筛选,结果显示Tat途径中的phoD信号肽分泌效果明显优于其他信号肽.在此基础上,通过替换使用诱导型表达载体、突变优化phoD信号肽,并考察了表达条件的影响,显著提高了脂肪酶LipS的分泌表达量,发酵液中转酯酶活达到62.07U/L,占总酶活的62.30%,较原始分泌表达体系的分泌量提高了13.7倍.
蛋白激酶B(AKT),在细胞存活、代谢、迁移和侵袭等信号通路中起着重要的调控作用.细胞信号转导抑制因子3(SOCS3)主要参与酪氨酸蛋白激酶(JAK)/信号传导子和转录激活子3(STAT3)传导途径的负反馈调节,可能参与AKT的磷酸化,进而调控肿瘤的发生.根据SOCS3蛋白的生物学特性和AKT信号通路的激活途径,综述了SOCS3在AKT信号通路中的调控作用,以期针对SOCS3靶向AKT信号通路进行抗肿瘤研究,为肿瘤的治疗提供一种新的思路.
微小RNA(miRNA)是一类真核生物内源性、长18~25个核苷酸的小分子单链RNA,能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对引起靶mRNA的降解或者翻译抑制,miRNA调节的紊乱将对细胞产生重要的影响.在肿瘤中,抑癌性miRNA的缺失会增加其靶向致癌基因的表达,而致癌miRNA(被称为oncomirs)的升高能够降低其靶向肿瘤抑制基因的表达.这一认识使得应用靶向致癌性miRNA与恢复抑癌性miRNA的功能来治疗肿瘤成为可能.随着临床研究的不断深入,miRNA不断为肿瘤分子诊断和治疗提供新的思路和治疗手段.
长链非编码RNA(long-noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200nt的非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA),不具有编码蛋白质的功能,直接以RNA的形式发挥作用,以诱饵分子、信号分子、引导分子和支架分子的方式在转录水平和转录后水平调节蛋白质编码基因的表达,参与细胞分化和个体发育等生命过程.lncRNA存在普遍的转录现象,但与蛋白质编码基因相比表达水平较低.基因组测序结果显示生物体内仅有少量的编码基因,绝大部分基因以非编码的形式存在于动物和植物体内起调控作用.近年来以miRNA和siRNA为代表的ncRNA的研究已经取得了丰硕的成果,而lncRNA的研究才刚刚开始,但是已经有研究表明lncRNA有广泛的生物学功能,如染色体修饰、X染色体沉默、干扰或激活转录和核内运输等.以转录组测序、微阵列和荧光原位杂交为代表的研究方法也在发展完善.
Alexa Fluor染料为罗丹明或香豆素的衍生物,是一种含有活性基团的有机荧光染料,具有激发光谱窄、发射光谱宽、量子产率高、光稳定性好,以及受温度、pH影响小等优点.近年来,Alexa Fluor染料作为荧光探针在细胞学和分子生物学研究领域取得了广泛应用,但对Alexa Fluor染料进行系统阐述的文章很少.因此,在综述Alexa Fluor染料的基本特征和优缺点的基础上,阐述其在细胞学和分子生物学研究中的应用,并对其应用和发展方向进行展望.
Mdm2 (murine double minute 2,又称为Hdm2)和MdmX (murine double minute X,又称为Hdm4) 的异常过表达与近半数的癌症直接相关,设计靶向Mdm2/MdmX-p53蛋白质相互作用位点抑制剂,解除Mdm2和MdmX对p53的抑制作用有着重要的临床意义.尽管Mdm2和MdmX结构非常相似,但仅有Mdm2小分子抑制剂的筛选和设计研究较深入.对依据nutlin分子构效关系、结构生物学、组合化学多重优化等手段筛设计MdmX抑制剂的研究进展进行简述,并讨论天然产物库在筛选MdmX/Mdm2抑制剂新型结构框架的应用前景.
重金属是一类会对植物产生毒害作用的污染物,植物在长期进化过程中演变出耐受重金属胁迫的相关机制.以植物重金属耐受性为基础,对近几年来国内外植物响应重金属胁迫的耐受机制研究作一简要综述.主要概述了重金属对植物的胁迫影响及植物抗氧化系统,脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等渗透调节物质和不同类型基因家族等方面对植物耐受重金属胁迫机制的研究进展.以期为提高植物耐重金属胁迫能力及研究植物修复重金属污染土壤的应用奠定一定的基础.
链霉菌一个突出的特征是具有合成丰富的次级代谢产物的能力,许多次级代谢产物,如抗生素、免疫抑制剂、抗癌物质等在临床医药、水产养殖业等领域具有重要的应用价值.链霉菌次级代谢产物的合成常与环境中的营养因子有着密切的关系,在代谢水平上综述了无机磷酸盐对链霉菌合成次级代谢产物的影响,并在转录水平上阐释了双组分信号转导系统PhoR-PhoP的分子调控机制.PhoR-PhoP能够感应环境中的无机磷酸盐信号,当无机磷酸盐的浓度低于一定"阈值"时,PhoP蛋白作为主导的调控因子将抑制参与中心代谢和次级代谢等一系列基因的转录表达,减慢磷酸盐的消耗,并激活磷酸盐的摄取和转运系统及时补充胞内的磷酸盐,最终影响链霉菌次级代谢产物的合成和形态发育分化.
微生物脂肪酶是商品化脂肪酶的主要来源,并广泛应用于诸多工业领域.与其他微生物脂肪酶相比,细菌脂肪酶催化反应的类型更多、活性更高、稳定性更好,其中又以假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶的性能最为优越.作为性能最为优越、应用最为广泛的一类脂肪酶,假单胞菌属脂肪酶研究一直是脂肪酶领域的热点.就假单胞菌属脂肪酶的分子生物学研究进展进行归纳和述评,包括基因资源挖掘及克隆、基因表达调控及分泌机制、活性过表达策略、蛋白质结晶及3D结构解析、蛋白质工程,并对其未来研究方向做出展望,以期为后续研究提供有益参考.
胞苷是合成抗病毒、抗肿瘤药物的良好中间体,也是核苷酸类保健食品和功能性食品的重要原料.主要论述了解淀粉芽孢杆菌高效合成胞苷的代谢调控机制和构建胞苷高产菌株的育种策略.重点阐述了通过提高解淀粉芽孢杆菌嘧啶操纵子转录水平,增强胞苷合成代谢途径、阻断胞苷降解途径、增大磷酸戊糖途径向胞苷合成途径的分流量、提高胞苷合成前端代谢物PRPP的合成量、增强中心碳代谢流向胞苷合成途径、减少旁路代谢途径及促进胞苷的分泌等方法,选育出胞苷高产菌株,不仅为胞苷高产菌株的选育提供参考,也为解决目前胞苷工业化生产中存在的问题提供思路.
