2013年, 第33卷, 第9期　
刊出日期：2013-09-25

  

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研究报告
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  基于T7启动子表达系统的呼吸道合胞病毒微型基因组的拯救

  袁锐, 付远辉, 何金生, 焦月盈, 蒋桂云, 张梅, 彭向雷, 阚学通

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 1-9.

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  目的:以T7启动子表达系统为基础,通过RNA病毒反向遗传学操作,拯救人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)微型基因组。方法:构建可分别表达RSV四种核壳体蛋白的辅助质粒px8δT-PT1-N,px8δT-PT1-P,px8δT-PT1-M2-1和px8δT-PT1-L以及含增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecent protein, EGFP)开放读码框(open reading frame, ORF),RSV病毒前导序列(leader region/genomic promotor),转录起始信号(gene start, GS)、转录终止信号(gene end, GE)和尾随序列(trailer region/antigenomic promoter)等顺式作用元件(cis-acting elements)的微型基因组重组质粒pSC11-E,在上述的5个质粒中,均引入T7 RNA多聚酶(T7 RNA polymerase, T7 RNP)启动子,经鉴定正确后,先以pSC11-E转染RSV感染的可组成型表达T7多聚酶的BSR T7/5细胞进行拯救,确定微型基因组编码质粒设计的合理性,而后通过5个质粒共转染BSR T7/5细胞,并通过荧光显微镜观察荧光的表达情况判断拯救成功与否。结果:成功构建了基于T7启动子表达系统的RSV微型基因组5质粒拯救系统,并实现了拯救。结论:该系统的成功构建,有助于今后对RSV病毒开展基因修饰研究。
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  酶联合消化法和贴块法分离小鼠肺动脉平滑肌细胞及其生物学特性的研究

  辛毅, 龚达, 习昕, 石洪涛, 刘飒, 许秀芳, 李娜, 黄益民

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 10-16.

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  目的:探讨适用于小鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)分离培养及鉴定的技术方法。方法:采用Ⅰ型胶原酶、木瓜蛋白酶联合消化法及组织贴块2种方法对PASMCs进行体外培养。在倒置显微镜下观察PASMCs的生长特点;台盼蓝法测定细胞传代成活率;分别对PASMCs行生长曲线、MTT法、DNA周期检测比较增殖情况;免疫荧光染色法鉴定细胞。结果:酶消化法分离培养的细胞1 d后,在倒置相差显微镜下可见细胞贴壁呈椭圆形生长,4d后生长迅速呈典型的谷-峰状生长,7d后达80%融合即可传代;贴块法培养的细胞3d后,可见细胞从组织块边缘长出,7d后细胞数量逐渐增多,10d后细胞生长迅速呈单层致密排列,细胞传代成活率均为96%。2种方法获得的第2代PASMCs经平滑肌ɑ-肌动蛋白(ɑ-SM actin)免疫荧光染色鉴定,其阳性率均为90%以上;生长曲线、MTT法显示细胞增殖及细胞DNA周期无明显差异。结论:2种方法均可高效获得PASMCs在体外稳定培养,为研究肺血管疾病提供较为理想的种子细胞。
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  Tat-PTD介导的金属硫蛋白高产量表达及其高效表达重组菌株重金属抗逆性研究

  李华玲, 王凯, 秦艳, 刘丹丹, 陈文飞

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 17-23.

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  目的:探讨Tat-PTDs对金属硫蛋白(metallothionein,MT)表达的促进作用及其体外高效表达重组菌株的重金属抗逆性。方法:采用聚合酶链式反应从小鼠肝脏组织中克隆了金属硫蛋白 MT-1和MT-2 基因的编码序列,进而分别亚克隆入原核表达质粒pET28b-Tat和pET28b,测序验证后转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞,采用1mmol/L诱导剂IPTG诱导表达,并于诱导表达0h,2h,4h,6h时收集菌体,超声破碎后制备总蛋白、上清蛋白和沉淀蛋白并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。针对上述诱导表达4hrs的菌液适量稀释后转接入新的LB培养基,采用分光光度仪测定高效表达金属硫蛋白菌株对5mmol/L铜的抗逆性。结果:Tat-PTDs可明显增加金属硫蛋白的表达产量,且Tat融合蛋白主要为可溶性表达;Western blot及其柱状图分析结果显示,Tat融合蛋白的表达水平约为非Tat融合蛋白的5~8倍;高效表达Tat-MT-1和Tat-MT-2蛋白的菌株具有明显的抗重金属铜的活性,与非Tat标签融合蛋白和空载对照组相比存在显著性差异(P<0.01)。结论:实验数据表明,Tat-PTDs蛋白转导技术可以促进小鼠金属硫蛋白基因在原核生物中的可溶性高表达,Tat融合蛋白的表达水平比非Tat融合蛋白的表达有显著提高,其克隆菌株对重金属铜活性的抗性也有明显提高。
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  重组蛋白TAT-NLS-Nkx6.2在大肠杆菌的表达纯化及活性测定

  孙少飞, 汪蓓蕾, 袁婷, 张斌, 张欣, 郭刚, 张瑞

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 24-30.

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  目的:构建重组基因 TAT-NLS-Nkx6.2 的原核表达载体,获得重组 TN-Nkx6.2 蛋白,并验证其生物学活性。方法:该实验先将人类免疫缺陷病毒HIV-1的反式激活因子TAT、核定位信号 NLS、Nkx6.2基因片段连接合成目的基因TAT-NLS-Nkx6.2 。之后构建重组质粒pET-28a- TN-Nkx6.2 并将其转化入E.coli DH5α中克隆,再转化至E.coli BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,经组氨酸Ni²⁺亲和层析纯化融合蛋白,并用SDS-PAGE及Western blot鉴定融合蛋白,荧光免疫组化染色观察TN-Nkx6.2在小鼠脑组织分布。结果:成功表达并获得纯度90%以上的TN-Nkx6.2蛋白,经 Western Blot鉴定,TN-Nkx6.2有良好的免疫原性和免疫反应性荧光免疫组化染色证明TN-Nkx6.2与小鼠大脑细胞结合并内化进入胞浆及胞核。结论:获得的融合蛋白TN-Nkx6.2具有生物学活性,并能穿过血脑屏障与小鼠大脑细胞结合,并内化进入胞核和胞浆,为深入探讨同源盒基因Nkx6.2在甲状腺减低模型的分子机制研究奠定了物质基础。
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  拟南芥SCBP60g蛋白的亚细胞定位及其功能研究

  万永青, 李瑞丽, 邹博, 万东莉, 王瑞刚, 李国婧

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 31-37.

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  为了研究 SCBP60g 的功能,研究利用Gateway克隆技术构建了GFP报告基因与拟南芥 SCBP60g 基因融合表达载体和基因功能互补表达载体并获得了转基因植物,通过激光共聚焦显微镜观察了SCBP60g蛋白的亚细胞定位情况,利用活体细菌生长量检测实验研究了SCBP60g蛋白在抗病中的功能;同时构建了 SCBP60g 过表达载体并检测了转基因植物对ABA的响应情况。结果显示,SCBP60g定位于细胞核; SCBP60g 基因不能恢复 CBP60g 基因突变体对丁香假单胞菌的敏感性;过量表达 SCBP60g 基因不影响拟南芥对ABA的敏感性。表明SCBP60g没有参与拟南芥的抗病防御反应以及对ABA的响应。
技术与方法
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  E.coli T蛋白CM的原核表达及核磁方法指导下的晶体优化

  芮斌, 谢长林, 江娜, 文汉

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 38-44.

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  越来越多的研究表明许多致病菌的病原性与生物体内莽草酸途径中的分支酸变位酶(chorismate mutase, CM)有着密切的关系,因此CM成为了开发新型抗生素和抗菌药物的热门靶标酶。采用分子克隆的方法,在感受态细胞BL21-Gold(DE3)中重组表达大肠杆菌(E.coli) T蛋白的CM(CM_T)。通过Ni-NTA亲和层析柱、GE Superdex75凝胶过滤层析柱和GE MonoQ阳离子交换层析柱纯化后得到电泳纯的重组蛋白,质谱鉴定结果与原始序列基本吻合。经过蛋白质晶体试剂盒的初步筛选,在30% PEG 4000,100mmol/L NaAc pH4.6,200mmol/L NH₄Ac条件中发现CM_T晶体。利用核磁共振方法,分析CM_T的¹H-¹⁵N HSQC谱图信息,指导设计CM_T晶体的优化方案,成功获得高衍射能力的CM_T晶体,为CM_T结构的解析奠定了坚实的基础。
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  重组sTNFR1蛋白包涵体洗涤方法的研究

  罗莉, 秦娇荣, 王明蓉

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 45-52.

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  目的:包涵体在变复性前通常需要用洗涤液多次重复洗涤以除去杂质,这种洗涤方式往往造成包涵体收率低或洗涤时间长或纯度不高,直接影响到重组蛋白产品最终的产量和质量。通过对sTNFR1包涵体的洗涤条件进行优化,以期指导该品种的工业化生产。方法:首先采用由脱氧胆酸钠和尿素组成的两因素五水平的析因设计,以洗涤后目的蛋白的含量为评价指标,进行方差分析,选出最优组合;通过对方差结果的分析提出不同于重复洗涤的分步洗涤方式,选出较优的分步洗涤方式;然后放大洗涤样品量,验证重复洗涤和分步洗涤的结果;另外,针对不同发酵批次和产量的样品,进一步验证比较重复洗涤和分步洗涤的效果。结果:重复洗涤的方差结果表明单独使用脱氧胆酸钠或尿素洗涤的产量优于两者的联合使用,但其纯度低于两者的联合使用,其中1mol/L尿素洗涤3次(W3组合)获得的目的产量最高;分步洗涤中2%脱氧胆酸钠洗涤第一次,2%脱氧胆酸钠+2mol/L尿素洗涤第二次的洗涤方式(FW6组合)既能有效提高目的蛋白纯度,又节约了时间,是较优的组合方式;同一发酵水平(约20%目的产量)不同规模样品(3g和50g)分别经过W3和FW6洗涤后,蛋白纯度提高到约26%和31%,且后者的目的收率高于前者,表明分步洗涤优于重复洗涤;针对不同发酵水平的样品(约10%和60%目的产量),分步洗涤的效果也优于重复洗涤,但对于低发酵水平的样品,分步洗涤对其纯度的提高更明显。结论:通过对该包涵体洗涤条件的摸索,找到一种较重复洗涤更有效的分步洗涤方法,既提高了目的纯度又节约了洗涤时间,为包涵体的洗涤提供了一种新的思路。
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  一种高效的真菌总蛋白质提取方法

  胡彬彬, 林连兵, 魏云林, 季秀玲, 张琦

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 53-58.

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  蛋白的提取是蛋白质组学研究的首要步骤,其质量的好坏直接影响蛋白质表达分析研究的开展及其结果的准确性。为了从深黄被孢霉M6-22中提取细胞总蛋白质并进一步进行蛋白组学等一些相关研究,采用五种已报道的蛋白质提取方法分别提取深黄被孢霉M6-22的总蛋白质,以蛋白质浓度和SDS-PAGE结果分析相结合的方法比较提取方法。结果显示,其中一种方法提取的蛋白质浓度相对较高而且蛋白质条带丰度最高,进一步对该方法进行了改良,所获得蛋白质的浓度可达约2.99mg/ml。改进后的方法操作步骤简单,蛋白质条带丰度更高。采用改进后的方法提取其他五种真菌的总蛋白质,结果显示其对其他真菌也有很好的提取效果,说明可作为一种真菌总蛋白质的高效提取方法。
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  水牛胎儿成纤维细胞电转染条件的优化

  罗婵, 任艳萍, 龚云, 杨素芳, 阮秋燕, 管晓梅, 蒋建荣, 石德顺

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 59-65.

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  高活力的转基因细胞的制备是转基因克隆动物研究的关键环节。为了高效制备转基因细胞,外源基因转入水牛胎儿成纤维细胞的条件需要优化。采用组织块贴壁法分离获得水牛胎儿成纤维细胞,经染色体核型分析表明获得的细胞具有正常的生物学功能,可用于细胞转染。采用电穿孔法将载体EGFP-N1导入水牛胎儿成纤维细胞,分别比较不同电压(200V,250V,300V,350V)、不同电击时间(5ms,10ms,15ms)和不同细胞代数(第3代、第5代、第10代)的转染效率,并利用优化的电转染条件将乳腺特异性表达的水牛促乳素(PRL)基因导入水牛胎儿成纤维细胞,G418筛选获单克隆并进行鉴定。结果发现电压为300 V,脉冲时间为10 ms时, 细胞GFP阳性率为35.5%,转染效率较高。随传代次数的增加,细胞的转染效率下降;传至第10代的细胞转染效率显著低于第3代的水牛胎儿成纤维细胞(30% VS 35.5%, P<0.05)。运用优化条件转染、筛选可获得转PRL单克隆细胞,转染效率为2.1×10^-5(84/4×10⁶)。挑取单克隆细胞扩大培养,经PCR鉴定和核型分析,证实单克隆稳定整合促乳素基因,并且核型分析正常,可作为核供体,用于生产水牛转基因克隆胚胎。为采用体细胞克隆技术生产水牛转基因胚胎奠定了基础。
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  农杆菌介导甘蔗愈伤组织遗传转化体系的优化

  秦翠鲜, 陈忠良, 桂意云, 汪淼, 周建辉, 廖青, 李杨瑞, 黄东亮

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 66-72.

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  以甘蔗胚性愈伤组织为材料,对愈伤组织增殖、分化、幼苗生根的最适抗生素(Km)浓度进行筛选,并对影响农杆菌介导的甘蔗遗传转化因素:预培养时间、侵染时间和共培养时间等进行了研究。最后确立了甘蔗愈伤组织增殖、分化及幼苗生根三个阶段的最适抗生素(Km)浓度分别为300 mg/L,40 mg/L,20 mg/L。确定了农杆菌浸染的预培养时间、侵染时间和共培养时间分别为4d,30min,4d。PCR检测表明,61.6%的抗性植株可扩增出预期的片段,表明外源基因已经整合到甘蔗基因组中。为进一步的甘蔗基因功能验证及转基因研究提供良好的技术支撑。
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  人工神经网络与遗传算法耦合法优化辅酶Q₁₀发酵培养基

  周勇, 郑毅, 宋利丹

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 73-78.

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  为了提高类球红细菌F3-40辅酶Q₁₀的发酵效价,对发酵培养基进行优化。通过单因子优化实验确定培养基中4种重要成分的浓度范围:葡萄糖25~40g/L、味精5~9g/L、硫酸铵3~7g/L、玉米浆粉5~9g/L。在此基础上采用均匀设计实验对4种成分进行组合优化,分别采取二次多项式逐步回归分析法、人工神经网络与遗传算法耦合法对均匀设计实验结果进行优化分析。结果表明,人工神经网络与遗传算法耦合法取得较好的优化效果,显著提高辅酶Q₁₀的发酵水平,最终辅酶Q₁₀的发酵水平达到245mg/L,比二次多项式逐步回归分析优化法(221 mg/L)、单因子优化实验(211 mg/L)、优化前(150 mg/L)分别提高了10.86%,16.11%,63.33% 。
综述
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  原核生物中蛋白质乙酰化修饰的研究进展

  毕静, 张雪莲

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 79-84.

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  近来发现,除组蛋白外,大量非组蛋白也存在赖氨酸乙酰化,并广泛参与细胞分化、细胞代谢等重要生理活动,赖氨酸乙酰化已成为生命科学领域研究的前沿热点。已有很多研究证据表明原核生物也普遍存在蛋白质乙酰化修饰现象,而且涉及中心代谢和中间代谢的很多代谢酶都存在乙酰化修饰现象。为更好了解乙酰化修饰在细菌中的重要性,对目前原核生物中蛋白质乙酰化修饰研究内容和最新进展进行综述,归纳原核生物蛋白赖氨酸位点的可逆乙酰化在中心代谢途径等重要生理活动中的调控作用。
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  治疗性抗体的研究现状与未来

  葛良鹏, 丁宁, 兰国成, 邹贤刚, 刘作华

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 85-93.

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  从全人源化抗体的研究进展,当前治疗性抗体的临床研究现状及未来治疗性抗体发展展望三方面介绍治疗性抗体的研究现状,分析未来发展趋势。首先比较了不同方式生产的全人源化抗体及其与部分人源化抗体之间的差异,详细阐述了噬菌体展示技术和转基因技术两种全人源化抗体生产关键技术的研究进展,各自的优势、不足及今后的发展方向;然后分析探讨当前治疗性抗体的临床现状、治疗性抗体的作用机制、治疗性抗体研究中靶抗原选择以及目前治疗用抗体生产和临床应用方面面临的关键技术问题;最后对未来治疗性抗体发展进行展望分析,指出小型化抗体、免疫偶联物、双功能抗体、细胞内抗体、Fc改造抗体、抗体糖基化改造及治疗性多克隆抗体将是未来抗体的重要发展方向。
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  杂合抗菌肽设计及生物学活性的研究进展

  武如娟, 张日俊

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 94-100.

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  随着抗生素在饲料中滥用导致的问题日趋严重,抗菌肽因其分子量小、抗菌谱广、抗菌活性高、耐热性强、不易产生抗药性、对高等生物正常细胞无毒害等优点已成为安全绿色抗生素添加剂替代品的理想选择。随着对抗菌肽结构、功能与杀菌机理研究的深入,人们开始尝试通过各种生物学手段设计杀菌活力更强、抗菌谱更广的杂合抗菌肽。从杂合抗菌肽的设计、生物学活性以及未来的研究方向等方面综述了杂合抗菌肽的研究进展。
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  植物DNA甲基化调控研究进展

  马浪浪, 江舟, 黄小波, 沈亚欧, 潘光堂

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 101-110.

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  DNA甲基化指在DNA甲基酶的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体将甲基转移到胞嘧啶上,形成5-甲基胞嘧啶的过程,它是真核细胞基因组重要的修饰方式之一,在植物生长发育过程中起着重要作用。综述了DNA甲基化调控的特征、维持机制、表观遗传现象及生物学意义、研究方法、在植物遗传育种中的运用等方面,旨在为其在作物遗传育种中更广泛的应用提供一定的参考依据。
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  产油酵母利用不同基质累积油脂的研究进展

  许继飞, 张艳芬, 赵桂琦, 赵吉

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 111-118.

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  产油酵母是一类能够产生并积累三酰甘油酯等脂质体的产油微生物,对日益严峻的能源与环境安全问题具有重要启示作用,寻找廉价易得且转化效率高的发酵基质将促进微生物油脂生产的工业化进程。本文介绍了产油酵母对各种基质的利用情况,包括混合糖类、纤维素类生物质、发酵过程产物、食品行业废水和其他有机质等;概述并比较了不同基质的油脂积累及产油特性,指出了目前产油酵母对各基质的利用问题和未来可能的发展方向。
讲座
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  移植细胞的种类及其有效性和安全性——细胞移植治疗连载之二

  王佃亮

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 119-125.

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  用于移植治疗的细胞主要有肝细胞、胰岛细胞、树突状细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等,每种细胞都有不同的生物学特性。在临床应用前,要严格按照国家食品药品监督管理局的有关规定,研究特定细胞制剂的生物学特性、药理学、毒理学等,进行动物和临床试验,确定适应症、禁忌症,评估有效性和安全性。正式获得国家食品药品监督管理局许可后,再进行相关临床研究和应用。
专稿
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  纪念中国生物工程学会成立20周年

  张树庸

  中国生物工程杂志. 2013, 33(9): 126-127.

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  1973年,美国斯坦福大学的科恩(S.N.Cohen)和博耶(H.Boyer)把两个嵌合质粒转入大肠杆菌表达成功,轰动了全世界。自此,基因工程的研究在世界范围内像雨后春笋般的开展起来。