利用重组PCR的方法，克隆并构建MyD88和MyD88aa155-171功能区缺失（MyD88?155-171）载体,转染免疫相关细胞并筛选获得稳定细胞系。报告基因实验结果显示MyD88?155-171功能区缺失能够抑制转录因子NF-κB和AP-1的活性，在不同Toll样受体（TLR）配体刺激后,转染MyD88?155-171的细胞表面分子的表达低于MyD88正常表达的细胞,并且抑制表面分子CD86和B7H1在TLR配体刺激后的上调。同时，多细胞因子分析系统的检测结果表明，给予TLR配体刺激之后，MyD88-/-树突细胞表达低水平的细胞因子，转染MyD88可以使细胞因子表达明显增加，而仅表达MyD88?155-171可以明显影响IL-12，IFN- 的表达。以上结果表明MyD88功能区缺失影响免疫相关细胞表面分子和细胞因子的表达及Toll 样受体信号的传递,其在细胞内信号系统的具体作用机制还需进一步证实。
目的：通过比较正常与脑出血及脑缺血模型大鼠脾淋巴细胞蛋白质表达的差异，初步探讨细胞免疫功能与脑血管病之间的关系。方法：将SD大鼠随机分为正常组、脑出血模型组（采用VII型胶原酶诱导脑出血）和局灶性脑缺血模型组（采用线栓法造成大脑中动脉阻塞），分离大鼠脾淋巴细胞，提取总蛋白质后进行双向凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，PDQUEST软件分析，对差异蛋白质点采用基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-TOF-MS）技术进行鉴定并分析。结果：胶质细胞成熟因子 等9个蛋白在脑出血和脑缺血模型组表达上调，膜联蛋白III在脑出血和脑缺血模型组表达下调。结论：建立了分辨率高重复性较好的脑出血及局灶性脑缺血脾淋巴细胞总蛋白的双向凝胶电泳图谱，并鉴定一些与脑血管病脑损伤相关的差异表达蛋白质，为深入研究脑血管病细胞免疫功能改变与脑血管病之间的关系奠定了基础。
目的 明确人促血液血管细胞生成素 (HAPO)对骨髓抑制小鼠的造血重建作用。方法 研究HAPO、G-CSF对骨髓抑制小鼠的促造血作用，以700 cGy 137Csγ射线全身照射的Balb/c小鼠为模型，观察照射后小鼠的生存率；检查血常规；计数内源性脾结节；计数骨髓细胞数；采用半固体培养基进行集落培养检测骨髓细胞的高增殖潜能；取小鼠骨髓细胞接种于96孔培养板，分别在照射前或照射后加HAPO、G-CSF培养72hr，MTT方法测定活细胞数；取小鼠骨髓细胞，分别在照射后加HAPO，培养3周后观察各组小鼠骨髓细胞的生长情况。结果 HAPO、G-CSF均可明显提高放射后的小鼠的生存率；使内源性的脾集落增加。照射后的各组小鼠外周血白细胞变化较为明显，HAPO组白细胞恢复快于PBS组，也可高于G-CSF组。各组小鼠骨髓细胞数虽然14天时G-CSF组最为明显，但32天时HAPO组骨髓细胞数超过G-CSF组，至42天时基本恢复正常；而G-CSF组在32天、42天时骨髓细胞数仍低于正常值。在7天、14天、32天时取各组小鼠骨髓细胞高增殖潜能检测试验，HAPO组生成的GEMM-CFU数均最多。在照射前与HAPO、G-CSF孵育的骨髓细胞，HAPO组活细胞数量比对照组明显增高，而G-CSF组与对照组无明显差异。骨髓细胞被照射后培养72hr时，MTT测定显示不同剂量HAPO、G-CSF均能促进放射后骨髓细胞的增殖。骨髓细胞被照射后继续培养3周，HAPO组均有造血岛生成，细胞sca-1、CD31呈阳性，周围CD31阳性的内皮细胞增多。而PBS组则未出现造血岛，基质细胞中极少有CD31阳性细胞的内皮细胞，未发现sca-1阳性细胞。结论 体内、外实验表明，人促血液血管细胞生成素HAPO对放射损伤的Balb/c小鼠有明显的促造血重建作用，提高小鼠的生存率，促进其造血干细胞的增殖与生长。
目的：从单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗DNA-PKcs的人源抗体，用于肿瘤治疗或诊断目的。方法：经抗原性分析及BLAST比对，选定人DNA-PKcs蛋白中抗原性高且与其他蛋白没有同源性的片段，进行原核表达及纯化后将其固定在抗原管上，通过4轮“吸附－洗脱－扩增”过程从大容量抗体库中筛选特异性抗体，转化HB2151菌，制备抗DNA-PKcs的可溶性单链抗体；ELISA检测抗原-抗体结合活性。结果：经生物信息学分析，确定抗原性高且与其他蛋白没有同源性的DNA-PKcs片段DPK3（250个AA）、DPK4（257个AA）。经过4轮筛选，获得26个特异性结合DPK3及31个特异结合DPK4的克隆，指纹分析分别有5种和21种不同的可变区片段；成功制备了可溶性抗体。并做了抗原结合活性鉴定。结论：利用单链大容量抗体库获得抗DNA-PKcs的噬菌体抗体基因并且成功制备成可溶性抗体，为今后的研究和应用奠定了基础。
摘要 目的 利用原核表达系统表达猪脑心肌炎病毒 (EMCV) 非结构蛋白3AB，并通过杂交瘤细胞技术制备其单克隆抗体，为相关研究工作奠定基础。方法 利用大肠杆菌系统表达具有良好抗原性的重组3AB蛋白，经包涵体纯化后免疫BALB/ c 小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞, 并结合免疫荧光(IFA)和Weatern Blot对抗体的特异性进行鉴定。 结果 经间接ELISA 筛选阳性的杂交瘤细胞, 获得1株能稳定分泌抗3AB蛋白抗体的杂交瘤细胞株，将其命名为2D12，其亚类测定为IgG1 /κ。Western Blot和间接免疫荧光试验证明该单抗能特异性识别3AB蛋白。结论 成功获得了针对EMCV-3AB 的特异性单抗,为进一步研究猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB的结构与功能及临床诊断试剂的研发奠定必要的物质基础。
目的 应用生物信息学方法预测质粒介导的AmpC β-内酰胺酶(pAmpCs)共有抗原表位，并实现pAmpCs共有抗原表位-Trx融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定。 方法 运用多序列比较工具找出各型质粒介导的AmpC β-内酰胺酶的共有相对保守区域，并利用分子生物学软件Biosun预测各亚型pAmpCs的可及性、抗原性、抗原表位、柔性、亲水性等参数，通过综合分析后找出其共有的抗原表位区域pAmpCs1。根据大肠杆菌的密码子偏好性，把氨基酸序列pAmpCs1转变为核苷酸序列pampcs1，采用重叠延伸PCR合成pampcs1片断，并构建原核表达载体pET32a(+)/pampcs1。通过测序验证，对含有该重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳分析后，用Ni-NTA亲和层析法纯化pAmpCs1-Trx融合蛋白，利用western blotting方法鉴定融合蛋白的抗原性。 结果 根据预测结果找到了一段各型pAmpCs共有的抗原表位区域pAmpCs1，成功构建了原核表达载体pET32a(+)/pampcs1，经IPTG诱导后得到了分子量约为23KD的融合蛋白，经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，通过western blotting鉴定该蛋白能被抗AmpC β-lactamases多抗识别。 结论 成功构建了pAmpCs1-Trx融合蛋白原核表达载体，并获得了高纯度的pAmpCs1-Trx融合蛋白，初步证明它的抗原性，为制备特异性抗体及建立快速检测方法打下了良好的基础。
采用PCR扩增法得到小鼠TAp63γ野生型及两种缺失突变体的cDNA，3种cDNA与表达载体pGEX-2TK重组构建成GST融合表达质粒并转化感受态E.coli BL21 (DE3)，经IPTG诱导了小鼠TAp63γ野生型及两种缺失突变体的可溶性表达. 诱导表达的菌液经离心收集菌体、超声破碎及Triton X-100增溶后获得可溶性表达蛋白粗提液. 利用Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲合层析纯化出电泳均一的3种GST融合蛋白. 凝胶滞留分析证实仅野生型小鼠TAp63γ蛋白能特异结合p53靶序列，经序列比对及同源建模分析，表明小鼠TAp63γ DBD结合区的完整性、关键氨基酸的保守性及三维结构的相似性可能是其DNA结合活性所必需的.
目的：制备以Ⅰ型促性腺激素释放激素（GnRH Ⅰ）为导向部分，以绿脓杆菌外毒素的结构域Ⅱ（PEⅡ）为转膜区，以丝瓜毒素luffinS2为毒性部分的重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS，体外实验检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。方法：重叠PCR法扩增GnRH-PEⅡ-luffinS的基因，克隆至表达载体pET32a中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取阳性克隆诱导表达，产物用Ni-NTA亲和层析柱纯化。纯化蛋白经重组肠激酶（rEK）切割去除Trx融合蛋白，XTT法检测重组毒素对HeLa、A549、HepG-2、SP2/0和鸡胚成纤维细胞（CEF）的体外细胞毒作用。结果：成功构建了GnRH-PEⅡ-luffinS的表达质粒，并在大肠杆菌中获得表达，纯化后的纯度为94％。GnRH-PEⅡ-luffinS对HeLa、A549、HepG-2和SP2/0的IC50分别为13.50μg/ml、13.74μg/ml、16.79μg/ml和26.07μg/ml，而对CEF无作用。结论：重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS对肿瘤细胞有较强的杀伤作用。
L-阿拉伯糖异构酶是生物法生产新型功能性因子D-塔格糖最为有效的酶。本文获得了一种新型耐热L-阿拉伯糖异构酶的编码基因araA，来源于Bacillus stearothermophilis IAM 11001，经NCBI Blastn分析，与GenBank中Thermus sp. IM6501 araA序列的同源性为95%，并将该新基因提交到GenBank,获得登陆号：EU394214。以pET-22b(+)为载体质粒，E. coli BL21(DE3)为宿主细胞，构建了基因重组菌，IPTG可诱导目的蛋白的过量表达；经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析，约在59 kDa处出现显著的特征蛋白条带；同时对重组L-AI的活性进行了初步研究，全细胞反应24小时D-塔格糖的转化率为39.8%。
应用 PCR技术从 Escherichia coli K12 Sgal- (ExPASy P23830) 中扩增到大小为 1350bp编码磷脂酰丝氨酸合成酶的 DNA片段，将其插入枯草芽孢杆菌诱导型表达载体 pBES，获得重组质粒 pBES-pss后转化 Bacillus subtilis DB104。经蔗糖诱导后，该磷脂酰丝氨酸合成酶在 Bacillus subtilis DB104 (pBES-pss)中获得胞外分泌表达，SDS-PAGE分析发现目的蛋白分子量约为 52kDa，酶联比色法检测酶活力为 1.50U/mL，提高了磷脂酰丝氨酸合成酶的表达产量，为工业化发酵生产磷脂酰丝氨酸合成酶奠定了良好的基础。
摘 要 目的 建立基于报告基因的组胺H3受体（H3R）激活剂的高通量筛选模型，用此模型对收集到的中草药化合物组分进行筛选，以发现新的组胺H3R激活剂。 方法 将H3R基因质粒（H3R/pCDNA3.1-hygro）与报告基因质粒（3XCRE-LUC）按3：1的比例共转染入HEK293细胞，建立了稳定的H3R配体的报告基因筛选细胞株。激活剂与细胞表面H3R结合后，激活相应的信号通路，调节Forskolin刺激后的报告基因的表达，通过测定荧光素酶报告基因表达水平的变化，评估激活剂影响H3受体的生物活性。 结果 通过对筛选条件，如激活剂孵育时间、Forskolin终浓度、化合物溶剂的选择、溶剂DMSO终浓度等的优化，建立了可靠的筛选方法，并对多种中草药萃取物进行了筛选，找到了两种对H3R有活性的中药组分。结论 建立的细胞模型可以有效的应用于以组胺H3受体为靶点的高通量药物筛选。
利用EL350基因工程菌进行同源重组，成功进行基因敲除已有报道，但利用该系统进行兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HPRT)基因突变和基因打靶方面的研究还没有报道。本实验首先在已经筛选到含有兔全长HPRT基因BAC克隆（LBNL1-304M19）的基础上，利用Red重组系统，通过Gap-Repair方式从此克隆上将一段47Kb无启动子的HPRT基因组片段（不含有第1个外显子）克隆到pBACLinkSp质粒上，产生pBACLinkSp-rHPRT质粒。然后基于pBACLinkSp-rHPRT质粒，设计不同的同源臂，从而删除了HPRT基因的不同编码区，成功构建了三个不同的HPRT基因打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。基于本实验所构建的三个不同的兔HPRT基因打靶载体，为探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件，及进一步获得兔HPRT基因敲除动物疾病模型奠定了基础。
质粒pRSET-A是一个常用的高效原核表达载体，编码一N端含组氨酸标签（6×His）的34aa前导肽序列，以方便利用抗组氨酸标签抗体鉴定或纯化所表达的重组蛋白。本实验设计一对两侧含编码疏水性氨基酸密码子的引物，经过扩增前导序列10~34aa基因序列，并重新克隆入质粒pRSET-A构建串联二聚体后，再利用质粒pRSET-A的BamH I / Bgl II同尾酶克隆位点，经一系列简单的酶切和连接，快速构建这一前导肽中不含组氨酸标签序列的串联多聚体基因，并成功表达其六聚体重组蛋白。将此重组蛋白主动免疫山羊，获得了能够特异地识别pRSET-A编码的N端前导肽序列的抗体。结果显示，所制备的羊抗10~34aa前导肽抗体能够识别pRSET-A指导表达的含有完整前导肽的重组蛋白，但不能识别不含10~34aa序列的重组蛋白；同时，利用同位酶技术可以快速高效构建短肽的串联多聚体以制备具有高免疫原性的亚单位疫苗或免疫调控物质。
目的：建立一种基于夹心免疫分析的抗体微阵列构建的优化方法。方法：将MCP-1的捕获抗体点样于修饰后的玻片，标准抗原加样覆盖所点阵列，生物素标记抗体和链酶亲和素-cy3依次加样孵育, 激光共聚焦扫描仪获取图象并进行数据分析。对捕获抗体浓度、封闭液种类、系统可重复性和定量检测能力、两种因子平行性检测对信号分析的影响及点样后玻片稳定性进行分析和评价。结果：随着捕获抗体浓度的升高，信号强度逐渐增加；2℅ BSA/PBS和5℅ 酪蛋白可作为本系统的封闭液；所构建系统具有较好的可重复性（组内变异 1.3%，组间变异8.7%）和定量分析能力（所建立的抗原浓度-相对信号强度标准曲线相关系数达0.9995）；并实现了两因子的平行性分析和点样后玻片的稳定性。结论：确立了基于夹心免疫分析的抗体微阵列构建的优化方法，为进一步构建多因子定量检测抗体微阵列奠定了基础。
本试验对沼泽红假单胞菌J001菌株250ml摇瓶发酵辅酶Q10条件进行了优化。结果表明其最佳初始pH值为6.5-7.5，温度为28-31℃，摇床转速100 r min-1，摇瓶装液量为200ml，接种量达10%时可直接进入对数生长期；碳源以NaAc较好，氮源以(NH4)2SO4和NH4Cl较好，磷源用量对考察指标影响不明显；用中心组合设计响应曲面法对碳氮源用量进行了优化，当NaAc浓度为5.39（g l-1），(NH4)2SO4浓度为0.385（g l-1）即碳氮比为14/1时，对菌胞生长最有利；当NaAc浓度为5.70（g l-1），(NH4)2SO4浓度为0.365（g l-1）即碳氮比为15.6/1时，对辅酶Q10产量最有利。
针对HCV基因组中较为保守的区域-5'UTR，设计一段GS引导序列，并与大肠杆菌RNase P的催化亚基-M1RNA的3'末端共价结合，构建序列特异性M1GS核酶-M1GS-HCV/C20。体外实验证实，所构建的人工核酶对HCV 5'UTR具有明显的靶向切割活性，且这种切割发生于靶序列的特定位点。本研究将为进一步阐明该核酶在胞内的活性、乃至动物模型内评价其抗病毒效果提供实验材料，从而为新型抗HCV药物及反义基因治疗的研究奠定基础。
本研究首先从桃中克隆了AGAMOUS(AG)同源基因PpMADS4的第二个内含子--pPpMADS4，全长约2.1kb。序列分析表明，该内含子含有一些对基因表达十分重要的调控元件。同时，克隆了七个不同桃品种中的PpMADS4基因的第二内含子，序列比对和SNP测算表明，PpMADS4第二内含子是一段SNP富集区域，具有高度的核苷酸多态性，但是在这段序列上各个调控元件的序列和位置都非常保守，暗示了这些调控元件可能具有很重要的生物学功能。为了认识这一内含子的调控功能，将pPpMADS4与minimal35S连接并与GUS基因融合，构建表达载体转入野生型拟南芥中。GUS染色显示，其表达主要分布在花的两轮生殖器官上，这与拟南芥中AG第二内含子调控的GUS着色部位相似，但存在着差异。PpMADS4第二内含子能够特异启动GUS在花发育晚期的表达。
利用盐析，离子交换，疏水层析及凝胶过滤的方法从雅致放射毛霉AS3.2778的发酵麸曲中分离纯化出一碱性蛋白酶，其纯化提高了22.7倍，酶活回收率16.1%，最终比酶活可达到6094u/mg。电泳分析发现，该蛋白酶是一单体蛋白，其分子量大约在32KDa。性质分析表明：该蛋白酶在60℃、pH8.5～10.5具有最大催化活性；在40℃以下，pH6.0～9.0的范围有很好的稳定性；1mM的PMSF可以完全抑制其活性，显示该蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族。底物专一性的研究发现，该蛋白酶有相当广泛的肽键选择性，对绝大多数由疏水性氨基酸（尤其是亮氨酸）构成的肽键有很强的水解能力。
精子形成过程中，基因表达经历了减数分裂性染色体失活，但有很多基因在减数分裂后期转录又重新被激活。转录产物研究表明，X和Y染色体特异基因在不同物种精子中都发生了不同程度的转录，并且对转录产物的研究方法也取得了巨大进展，产生了微阵列、SAGE及抑制消减杂交等先进的技术手段，随着这些技术的日益成熟和完善，通过深入研究,精子中性别相关基因转录表达调控机理将越来越清晰，并推动性别特异蛋白的研究取得更大进展。
细胞电融合（cell electrofusion）是一种发展迅速的细胞工程技术，在细胞融合研究领域得到了最广泛的应用。细胞电融合利用细胞在相对电极之间的介电电泳，诱导细胞按特定方向排列，通过电极间产生的较高场强的电脉冲使相互接触的细胞发生电穿孔，进而发生电融合。融合后的细胞得到了不同细胞的遗传物质，具有新的遗传或生物特性。目前，细胞电融合技术对生物医学、农业等相关领域的研究具有非常重要的意义。本文介绍了细胞电融合技术及其最新研究动态，并简单介绍了本实验室在该领域的研究进展。
宫颈癌的发生与高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染高度相关已得到公认。利用基因重组技术开发HPV疫苗是目前预防宫颈癌唯一有效的方法。文章综述了近年来在基因工程HPV疫苗研制中广泛应用的载体表达系统及其特点、依据密码子偏爱原则优化病毒外壳蛋白基因序列显著提高外壳蛋白产量等方面的研究成果，以为进一步研制与优化HPV疫苗提供参考。
植物生物反应器被称为"分子农田"，它具有无限生产重组蛋白的巨大潜力。利用转基因植物表达的重组蛋白具备原有的理化性质和生物活性，从而为人类提供了一种大量生产药用蛋白的安全可靠、经济、方便的新生产体系。目前已广泛运用于工业、农业尤其是生命科学以及医学制造领域。用植物生物反应器产重组疫苗、重组抗体和其他药用蛋白已成为国内外基因工程研究热点之一。然而，转基因植物产物的表达量、下游加工等问题却也成为利用植物生物反应器应用的限制因素。本文就其优势、近三年内国内外转基因植物生产药用蛋白的研究进展、存在问题及对策作一综述。
