艾滋病肆虐全球,已成为世界上危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。疫苗在预防和控制艾滋病中具有重要意义,理想的HIV疫苗必须能够产生广泛的交叉反应性中和抗体、有效的抗病毒细胞毒性T细胞(CTL)反应。近年来,核酸疫苗的研究已经取得了可喜的进展,科学家正不断努力研制更有效、更强大、更广谱的新型疫苗。综述了艾滋病核酸疫苗的载体改造、抗原选择、免疫策略等方面的研究进展,并对其今后的研究发展方向进行了阐述。
马传贫病毒是反转录病毒科慢病毒属的成员之一,它在体内要通过反转录酶的作用合成DNA,整合到宿主的基因组中进行复制,由于反转录酶没有校正功能,使病毒在体内复制过程中错误拷贝RNA基因组,导致高频率的遗传变异。近年国内外学者对EIAV的研究发现变异的基因主要集中在env、gag、LTR和S2等区域,这些区域基因的变异与病毒的毒力、病毒在体内的复制水平及免疫原性密切相关。由于EIAV是慢病毒中最简单的病毒,它具有独特的发病进程和明显的病程分界,使其成为研究包括HIV内其它慢病毒基因变异与临床症状之间相互关系的理想动物模型。因此对EIAV基因变异情况的研究具有重要意义。
小鼠B族Ⅰ型清道夫受体是目前已确认的唯一真正介导细胞与高密度脂蛋白作用的膜受体,主要在肝脏和固醇生成组织中表达,并受促激素、胆固醇、饮食以及药理等因素所调控。该受体介导高密度脂蛋白-胆固醇酯的选择性吸收,是调节胆固醇逆转运的唯一靶点,在高密度脂蛋白代谢和胆固醇运输中起重要作用。该基因缺陷对不同的组织具有不同的影响。它有可能作为一个新的治疗靶点来预防和治疗动脉粥样硬化性心脑血管疾病。对其分子结构、表达调控及相关研究作了详细介绍。
骨形态形成蛋白因子Ⅱ(BMP-2)属转化生长因子TGF-β超家族成员,具有活性最高和能单独诱导骨形成的特性。BMP-2能促进成骨细胞分化和增加成骨细胞标志基因的表达,这在成骨细胞分化过程中起非常关键的作用,最终促进骨形成。因此BMP-2可作为治疗骨质疏松症药物的新作用靶点。目前,已证明可上调BMP-2表达的上调剂多为Statin类药物。它们多通过抑制Rho和Rho激酶的活性;增加游离的有活性的eNOS;抑制HMG-CoA还原酶的活性等方面促骨形成。研究Statin类药物促BMP-2表达上调的机理,可为进一步寻找更有效的治疗骨质疏松症药物提供新靶点和新思路。
目的:将体外预先标记的骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)移植到大鼠脑内观察细胞的存活和转归,从在体(invivo)角度阐明MSCs在中枢神经系统疾病细胞治疗中的潜在应用前景。首先用DiI在体外标记MSCs。将标记后的MSCs分别移植到大鼠纹状体和侧脑室,在移植后2w和4w灌杀动物,进行脑组织及脊髓的冰冻切片,在荧光显微镜下观察细胞的存活与转归。结果:移植到纹状体的MSCs可沿针道向周围实质迁移,迁移的最远距离可达0.2mm。并且,在大脑皮层及其他脑实质的血管壁、血管中以及血管周围还可见到标记细胞;而移植到侧脑室的MSCs则主要沿脑室系统迁移,细胞主要分布在移植侧侧脑室,对侧脑室与第四脑室也有分布,也有少量细胞沿侧脑室向周围实质迁移,迁移的最远距离为0.23mm。还可见到沿胼胝体向对侧脑室迁移的细胞流,甚至有个别细胞迁移至脊髓腰段。所有动物在细胞移植后4周均未发现肿瘤形成。结论:MSCs脑内移植后可以在中枢神经系统内存活并迁移,无致瘤性。结果提示骨髓间充质细胞是很多疾病细胞与基因治疗的有力工具。
为了提高重组大肠杆菌BL21高密度发酵生产类人胶原蛋白的产量,分别研究了诱导时机、乙酸浓度、诱导强度以及补氮方式对外源基因表达的影响,并对各因素进行了优化。采用补料-分批式发酵,初始装液体积为6L。最终细胞密度可达到84.3g／L,类人胶原蛋白的表达量为14.6g/L。结果表明:在对数生长的中后期进行诱导,尽量减少乙酸的积累量,42℃诱导3h后降温至39℃继续诱导,并采用每隔10min补36ml补料氮溶液的周期操作方式,有利于细胞的生长和外源蛋白的表达。
目的:研究中老年人骨髓间质干细胞(MSCs)的生物学特性。方法:用Ficoll-Paque分离不同年龄段供者MSCs体外培养,进行诱导分化,用流式细胞术检测表面标志,核型分析观察细胞染色体的稳定性,裸鼠实验、软琼脂实验观察致瘤性。结果:中老年人每毫升骨髓分离的单个核细胞量和MSCs增殖速度与青年人无显著差异;中老年人不同代次的MSCs诱导后具有向成骨细胞和成脂细胞分化的能力;分离培养的MSCs表达CD44,不表达CD34;传至第10代核型未见异常,未见致瘤性。结论:中老年人MSCs有较强的体外增殖能力和多向分化潜能,遗传背景稳定。
目的:通过野生型bFGF和改构型bFGF蛋白溶液中的聚集过程的比较,初步探讨bFGF在水溶液中发生聚集的机理。方法:在选择合适溶液体系后,采用蛋白溶解度和促有丝分裂活性能力为指标,表征野生型bFGF和突变型bFGF聚合程度,分析共价聚合和非共价聚合所起的作用。结果:在相同的溶液体系中,野生型bFGF的聚集程度高于突变型bFGF。bFGF聚合程度与浓度有依赖性。沉淀结果分析非共价聚合占主要作用。结论:野生型bFGF在溶液中共价聚和和非共价聚合同时发生,两种bFGF聚合过程中非共价聚合占较大比例。突变半胱氨酸可以减少聚合发生。
以牛型分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR方法扩增mpb64基因,纯化PCR产物并与pDM18-T载体连接、转化,经酶切及核苷酸序列鉴定为正确后,酶切产物亚克隆到原核表达载体pET30a(+)的KpnI／EcoRI位点,构建重组表达质粒pET30a+-mpb64,转化到大肠杆菌DE3内,以IPTG进行诱导,终浓度为1mmol／L,诱导产物进行SDS-PAGE电泳。结果表明,PCR方法成功扩增出mpb64基因,核苷酸序列测定验证了其正确性,重组表达质粒表达的pET30a+-mpb64融合蛋白相对分子量为30.4kDa,与实测相符。牛分枝杆菌pET30a+-mpb64的成功表达为牛结核病的诊断及新型疫苗的研究奠定了基础。
用PCR方法从克隆质粒pUC19-RTA中扩增出蓖麻毒素A(RTA)链基因,序列分析正确后,亚克隆到原核表达质粒pET-His中,构建重组表达质粒pET-HisRTA,再转化到E.coliBL21(DE3)plysS中获得表达工程菌株BL21/pET-HisRTA。该工程菌在30℃经0.4mmol／LIPTG诱导4h后获得可溶性表达的目的蛋白,约占菌体总蛋白的18.45％,SDS-PAGE分析显示表达的蛋白区带与RTA相对分子量相符,约32kDa左右。表达产物经Ni-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度约达97.53％,并可得到约18mg/L重组RTA蛋白。Western印迹和间接ELISA结果证明,重组RTA蛋白与抗天然蓖麻毒素多抗可发生特异性的抗原抗体反应,具有良好的抗原性,这为制备RT特异性抗体及建立RT的检测方法奠定了基础。
在大肠杆菌中用pET28a表达载体表达重组RNaseA。变性条件下,利用His-Resin亲和纯化,得到60mg／L电泳纯的RNaseA。纯化的RNaseA复性后,利用含大量RNA分子的碱法抽提质粒为底物,测定重组RNaseA活性,与商品化的RNaseA活性相当。同时在RNaseA活性测定体系中加入4mol／L尿素会使RNA分子切割效率提高10倍左右。在此基础上,成功表达RNaseA与链亲和素(streptavidjn)的融合蛋白,经纯化复性后,该融合蛋白同时具有核酸酶、biotin结合活性,在分子生物学中具有重要的应用价值。
构建了霍乱毒素B亚单位(choleratoxinBsubunit,CTB)与胰岛素(insulin)B链的融合基因CTB-INSB,将该融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pETCIB;并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中;重组菌株经IPTG诱导后的表达产物经15％SDS-PAGE分析表明可以表达融合蛋白,其分子量约为15.4kDa,且主要以包涵体形式存在,约占全菌蛋白的30％。含CTB-INSB重组蛋白的包涵体经变性和复性后,可在体外自组装成五聚体结构。Westernblotting分析结果显示CTB-INSB可分别被霍乱毒素的抗体和胰岛素的抗体识别,表明该蛋白具有霍乱毒素B亚单位与胰岛素的双重抗原性。同时GM1-ELISA分析结果表明CTB-INSB在体外可与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异结合,进一步证实了它能够形成类似CTB五聚体的高级结构,具有生物活性。
利用基因特异引物YMTSP1和YMTSP2,通过RT-PCR从牦牛肝脏组织RNA中克隆出了牦牛MT-Ⅰ(GenbankAccessionNo:AY513744)和MT-Ⅱ(GenbankAccessionNo:AY513745)基因编码区全长。将牦牛MT-Ⅰ和MT-ⅡcDNA序列在CBI上进行同源性搜索发现,牦牛MT-Ⅰ/-Ⅱ编码区序列在不同哺乳动物中相当保守。牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ编码的MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白分别由61个氨基酸组成,其具有保守的短肽结构如:C-X-C,C-C-X-C-C,C-X-X-C等,其决定MT蛋白分子的整个三维结构,在分子进化上十分保守。同时对牦牛MT的疏水性和跨膜区分析表明,牦牛MT蛋白可能不存在跨膜区,也不存在信号肽,是1种非分泌蛋白。并通过同源比较模建,预测和构建了牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白的分子空间结构,表明牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ由α-和β-两个结构域组成,在α-结构域含有5个Cys短肽结构,β-结构域有4个Cys短肽结构,且2个结构域由保守的三肽序列KKS相连。
目的:利用结构相似性的序列比对来模建ICOSIg的三维结构,分析其可能的结合位点,为改造ICOSIg的突变体,提高其结合活性提供理论基础。方法:利用生物信息学手段分析ICOS所属CD28家族各成员分子的结构域,通过基于结构相似的序列比对,以空间结构已经得到解析的CTLA4为模板,利用同源模建的方法,模建ICOS膜外区的空间结构。进一步地以人IgG2和CTLA4为模板,模建了ICOSIg全长的空间结构。在此基础上,结合氨基酸特性,分析其可能的功能位点。结果:FDPPPF及KTKGSGN基序可能是ICOSIg的功能结合位点。结论:模建了ICOSIg的空间结构,分析了其可能结合位点,为突变ICOSIg提高其亲和力提供了线索。
