在简要介绍微生物谷氨酰胺转胺酶的主要功能、应用和国外研究成果与目前状况后,指出该酶生产微生物菌种选育的重要性以及实际难度和艰巨性,阐述了进行初筛、复筛和常规诱变育种试验的关键技术手段及其成果效益。利用这些有效方法获得性能优良的高产酶突变菌株,进行规模化发酵工艺条件和酶制剂产品分离提纯技术研究,并在此基础之上,进一步开展通过“神舟”四号飞船搭载的微生物空间诱变育种研究强化产酶菌株的各种优良性能,说明了空间多种复合因素引发的综合搭载效果显著。
HIVTat蛋白转导域(proteintransductiondomain,PTD)是新近发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域,它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞,甚至可以通过血脑屏障,转导效率很高而且对细胞没有损伤。TAT融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具,在基础医学研究和临床治疗方面都有着非常广泛的应用前景 。
介绍了卡那霉素在转基因植物筛选中的作用机理及其在植物转化过程和转化后代中的应用现状。卡那霉素不仅在植物转化过程中可起到筛选作用,而且在转化后代中可通过其对后代进行遗传分析和测定种子纯度,同时还可用于后代田间成株的筛选。随着卡那霉素的广泛使用,卡那霉素抗性基因的安全性问题日益受到重视。概述了转基因植物的杂草化、卡那霉素抗性基因的水平扩散、抗生素医疗安全性和食用安全性等方面的研究进展 。
肉毒碱脂酰转移酶包括肉毒碱棕榈酰转移酶、肉毒碱乙酰基转移酶和肉毒碱辛酰基转移酶,它们对脂肪酸的进一步β氧化代谢起到了转运的作用。综述近年来对肉毒碱脂酰转移酶族成员酶学特性的研究进展,探讨在热带假丝酵母(Candidatropicalis)中肉毒碱脂酰转移酶的作用与调控 。
Oleosin是一类特殊贮藏蛋白,主要在植物种子特异表达,覆盖于油体表面,在油体发生到分解消失过程中起着重要的生物学作用,在植物基因工程研究中有重要的应用价值。介绍oleosin的分类、分布、基本组成、结构与功能、oleosin基因及其表达,讨论oleosin在植物基因工程中的应用 。
转基因植物具有抗病、抗虫、抗逆、高产、营养成分改善等优良性状,但其安全性引起了人们的关注。新一代植物转基因技术,如叶绿体基因工程、基因约束、多基因共转、去除抗性标记基因、对外源基因进行实时监控、抗性管理策略、最小程度地改变基因等技术的发展,将使未来的转基因植物更好地适应人们的需求,更有利于消费者食用安全和生态环境的可持续发展 。
无毒基因编码的产物激发病原物与植物特异性相互作用。水稻与稻瘟菌之间的特异互作符合“基因对基因”关系。从研究稻瘟菌无毒基因的意义、已鉴定和克隆的稻瘟菌无毒基因、稻瘟菌无毒基因与其抗病基因的互作特点等几个方面,对稻瘟菌无毒基因研究进展作了简要评述 。
对转基因植物生产口服疫苗的发展、优点与作用机理、方法原理进行介绍,概述当前各种转基因植物疫苗的研究现状,指出了转基因植物疫苗研究面临的问题与前景 。
以牛儿基牛儿基二磷酸为前体的紫杉醇生物合成大约有20步酶促反应,其反应过程已基本阐明,近一半的相关酶基因已得到克隆与表达。综述了编码参与紫杉醇生物合成的紫杉二烯合酶、紫杉二烯5α羟化酶、紫杉烷10β羟化酶、紫杉烷13α羟化酶、紫杉二烯5α醇O乙酰基转移酶、紫杉烷2α苯甲酰转移酶、去乙酰基巴卡亭Ⅲ10βO乙酰转移酶、3氨基3苯基丙酰转移酶和3N去苯甲酰2脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶等9个酶基因的克隆和表达方面的研究情况,并指出随着紫杉醇生物合成的分子生物学研究的不断深入,利用分子生物技术大规模生产紫杉醇将为期不远 。
以SARS病毒基因组序列为基础,采用GarnierRobson方法、ChouFasman方法和KarplusSchulz方法预测蛋白质的二级结构;按KyteDoolittle方案、Emini方案和JamesonWolf方案预测SARS病毒M蛋白的B细胞表位。预测结果表明,在SARS病毒M蛋白N端第11～20、27～36区段和第133～141区段可能是α螺旋中心;M蛋白分子N端第20～27、34～37,44～56,61～64,70～76,79～97,117～132,142～147,165～176区段和第216～221区段可能是β折叠中心。在M蛋白N端第5～6、40～44、105～107、112～116、189～190、202～203区段和第210～215区段具有较柔软的结构,有可能进行一定幅度的摆动或折叠而形成较复杂的三级结构。SARS病毒M蛋白N端第1～15、37～47、99～120、181～192区段和第196～215区段内或附近很可能是B细胞表位优势区域。以蛋白质的二级结构预测作为辅助手段,用抗原指数,亲水性参数和可及性参数预测SARS冠状病毒M蛋白的B细胞表位,为实验确定SARS病毒M蛋白的B细胞表位和免疫识别研究奠定了基础 。
研究重组可溶性TRAIL的抗肿瘤生物学活性。采用基因分子生物学方法构建重组可溶性TRAIL的表达载体,建立大肠杆菌表达菌株,采用柱层析等方法获得纯化的重组可溶性TRAIL;采用流式细胞术、细胞活性测定法和体内药效学实验分析重组可溶性TRAIL杀伤肿瘤细胞的生物学活性。结果表明重组可溶性TRAIL在体外可诱导人白血病细胞和肝癌细胞凋亡,凋亡率达50%以上。中枢神经系统的肿瘤细胞对重组可溶性TRAIL不敏感。重组可溶性TRAIL在体内能显著抑制人非小细胞肺癌细胞在小鼠体内生长,抑制率达70%以上。结论为研究制备的重组可溶性TRAIL能在体内外杀死多种肿瘤细胞,具有显著的临床应用前景。
哺乳动物合子基因组激活和植入前胚胎阶段特异性表达基因的研究一直是发育生物学研究的重点。发现和克隆植入前胚胎阶段特异性表达的基因需要有效的方法,阶段特异性cDNA文库的构建和筛选是一种较好的方法。用小鼠单个成熟卵细胞、受精卵、2细胞、4细胞和8细胞胚胎分别构建了cDNA文库。滴度分别为:62×105、83×105、104×106、151×106和162×106。随机挑选了29个克隆并进行了序列分析,结果表明,和已知表达序列标签(ESTs)同源的序列为6552%(1929),未知序列为1379%(429),并发现了2个重复序列。用特异性引物,分别对小鼠持家基因(βactin)和发育特异基因(OCT4)进行PCR扩增,结果表明,所建立的cDNA文库可以反映小鼠胚胎在不同发育阶段整个基因群体的转录活性,为阶段特异性基因的筛选和小鼠早期阶段基因表达模式的研究提供了一种有价值的资源库 。
通过计算机分析Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G的氨基酸序列,筛选出HSV1gG蛋白中优势抗原决定簇位点,用PCR技术扩增克隆含强抗原决定簇较集中的基因片段。将该段基因克隆至质粒表达载体pGEX4T2内,转化大肠杆菌TG1,构建成功了高效表达Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因的工程菌。用纯化的表达蛋白HSV1gGGST作抗原ELISA分析证实有较好的抗原性和特异性,显示可应用于单纯疱疹病毒感染的诊断 。
以17α甲基睾丸酮投喂赤点石斑鱼(Epinephelusakaara),成功地获得了性逆转的有功能的雄鱼。用SMARTcDNA合成和长片段PCR技术构建了性逆转前后脑垂体cDNA文库;用抑制消减杂交技术建立了性反转前后抑制性差减文库。对获得的560个雄鱼脑垂体PCR阳性克隆和350个雌鱼脑垂体PCR阳性克隆进行斑点杂交,共筛选到103个差异表达cDNA片段。对其中29个克隆进行了测序,与GenBank中的已知基因序列进行同源性比较,发现有6个片段为促性腺激素α亚基前体基因(GenBank注册号:AY207430),与同属不同种的石斑鱼促性腺激素α亚基前体基因有97%的同源性;1个片段为生长激素前体(GenBank注册号:AY207431),与同属不同种的石斑鱼生长激素前体基因有99%的同源性;其余22个cDNA片段与GenBank中的序列无明显同源性 。
对基因工程猪生长激素(rpGH)体外复性条件进行研究,提取包涵体用6molL盐酸胍溶解,空气氧化80h后转入复性缓冲液中开始重组蛋白复性,结果表明,采用透析复性法———复性缓冲液Ⅲ(025%Na2CO3,02%乳糖,02%甘露醇),pH85,透析5～6次,可较好恢复rpGH生物活性。β巯基乙醇、谷光苷肽等添加剂对rpGH的体外复性影响不显著。复性后蛋白浓缩液进行去垂体大鼠试验,大鼠增重明显,表明得到了正确折叠的较高生物活性的rpGH。
制备抗有机磷杀虫剂单克隆抗体。采用人工合成带有特殊功能基团的半抗原,将其与载体蛋白偶联,以半抗原偶联物为免疫原,免疫BALBc小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,HAT选择、有限稀释法克隆化,建立分泌抗机磷杀虫剂单克隆抗体的杂交瘤细胞系。ELISA间接法和ELISA竞争抑制法检测抗体滴度,非竞争抑制法检测抗体亲和常数。结果获得9株分泌抗机磷杀虫剂单克隆抗体的杂交瘤细胞系,其中7株为型特异性,2株为组特异性;Ig亚型均为IgG1;亲和常数为407×108±043M和127×109±024M。结论为人工人工合成的、含特殊功能基团的半抗原,与载体蛋白偶联后,做免疫原,可用于制备高滴度的抗有机磷杀虫剂单克隆抗体,这种单抗可用于机磷杀虫剂残留物的免疫化学检测 。
根据锌的耐受量实验,筛选对锌吸收较好酵母为实验菌株。研究培养条件对酵母细胞锌的含量及生物量的影响,提出药用锌酵母扩大培养工艺流程,探讨药用锌酵母中有机锌的形态,锌的吸收率,锌酵母的毒理分析及应用 。
根据已发表的马流感病毒血凝素基因序列,设计并合成一对特异性引物,经反转录聚合酶链反应(RTPCR)成功扩增出了我国马流感病毒青海株(AEquineQinghai194)、吉林株(AEquineJilin189)及黑龙江株(AEquineHeilongjiang189)血凝素基因,将片段分别连接到PGEMTeasy载体并转化DH5α,提取阳性菌落的质粒经EcRo1酶切和PCR鉴定其大小均为17kb左右,对其测序并构建HA基因进化树。经过比较分析,青海株与AEquineKentucky286、AEquineMiami163等关系较近,核苷酸同源率为973%～847%,而与我国马流感吉林株和黑龙江株关系较远,同源率仅为552%。经过比较,青海株与我国香港1992年马流感病毒关系密切 。
海兔酸性多肽(Aplysiaacidicpeptide,AAP)和海兔胰岛素Cβ(AplysiaInsulinCβ,AICβ)的一级结构分别由27和15个氨基酸残基组成,其中前者含有6个亮氨酸残基(L),并组成3对LL键,后者仅有2个亮氨酸残基,组成1对LL键。选用基质辅助激光解吸离子化飞行时间(matrixassistedlaserdesorptionionizationtimeoffight,MALDITOF)质谱技术研究AAP,AICβ和它们分解产物的一级结构稳定性过程中,发现在弱酸性介质条件下,AAP和AICβ的LL酰氨键键能比LR键能(R表示除了L以外的氨基酸残基)更强,不易被分解。AICβ和猪血管紧张肽I(angiotensinI,AnI)样品中均含有单电荷的多聚肽。随着多肽聚合数递增,多肽质谱峰的相对强度剧减。AICβ在形成多聚肽过程中,发生释放H+的现象 。
利用高效液相色谱(HPLC)建立了测定鱼体的鱼血,鱼脑,鱼肉和鱼肝中的鱼静安(MS222)的浓度方法,样品用重蒸水匀浆,离心15min(12000r/min),将上清液用045μm过滤膜过滤,用YWGC18分析柱,流动相为02mol/min磷酸缓冲液(pH31)∶甲醇=85∶15,紫外测试波长223nm,平均回收率鱼血8778%,鱼脑9530%,鱼肉9230%,鱼肝7700%。
刺桐属胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,能特异性的抑制胰蛋白酶、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、瑞替普酶(rPA)等丝氨酸蛋白酶。实验利用ETI工程菌,经诱导表达、体外复性及纯化获得ETI蛋白,并将该蛋白键合到CNBr活化的琼脂糖凝胶,制备ETI亲和填料,纯化瑞替普酶 。
建立荧光分子信标探针方法,探讨乙肝病毒对拉米夫定耐药的发生及病程进展。观察77例乙肝病人口服拉米夫定治疗前及治疗后12个月及24个月肝功能(ALT)及免疫学指标及检测HBVDNA含量,并采用PCR荧光分子信标技术检测YMDD耐药突变株(包括YIDDYVDD突变株)。结果表明,口服拉米夫定12个月或24个月,近半数病人血清HBVDNA转阴(小于01pgml),35%(2777)的病人出现e抗原血清转换或单纯e抗原转阴,而e抗原血清转换绝大多数发生于HBVDNA低于100pgml血清的病人。30%(2376)的病人出现YMDD耐药(YIDDYVDD),在HBVDNA小于10pgml(106拷贝ml)的病人中YMDD耐药株与野生株共存。加大口服拉米夫定剂量,绝大多数YMDD耐药株仍不能转变为YMDD野生株。提示中国乙肝患者YMDD耐药后不适合加大剂量继续使用拉米夫定治疗 。
从国际农业生物技术的发展趋势,看农业生物技术在现代中国农业发展中的重要地位和作用。分析了我国农业生物技术发展的现状和面临的挑战,提出在日益激烈的国际农业竞争环境中,我国农业生物技术的发展战略和措施 。
