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中国生物工程杂志

CHINA BIOTECHNOLOGY
中国生物工程杂志  2010, Vol. 30 Issue (03): 79-84    
技术与方法     
利用Red同源重组技术构建产L-苏氨酸的基因工程菌
闫继爱1,2,张雪1,2,张芸2,左佃光2,陈宁1,温廷益2**
1. 天津科技大学生物工程学院 天津 300457
2.中国科学院微生物研究所 北京 100101
Construction of Genetic Engineering Strains for L-threonine Production by Red Recombination
1.College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China
2.Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
 全文: PDF(636 KB)   HTML
摘要:

利用Red重组技术构建不同基因突变的L-苏氨酸工程菌大肠杆菌ITHR,研究单敲除metA、ilvA和双敲除metA、ilvA基因后对L-苏氨酸积累的影响。应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组酶在FRT位点发生第二次同源重组,消除抗性基因,成功敲除了菌株ITHR体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中的metA和ilvA基因,构建了三株不同的基因突变株。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065电转化入敲除不同基因的突变株中,构建基因工程菌。经5 L发酵罐发酵产酸实验,未敲除任何基因的菌株ITHR/pWYE065 L-苏氨酸的产量为5.55±0.51 g/L,metA基因单敲除菌株ITHR△metA/pWYE065 L-苏氨酸产量为9.77±1.83 g/L,ilvA基因单敲除菌株ITHR△ilvA/pWYE065 L-苏氨酸产量为8.65±1.42 g/L,同时敲除ilvA和metA基因的菌株ITHR△metA△ilvA/pWYE065 L-苏氨酸的产量增加到13.6±1.14 g/L。通过敲除L-苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因,可以增强L苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。

关键词: 大肠杆菌Red同源重组基因敲除L-苏氨酸发酵    
Abstract:

The threonine genetic engineering strains were constructed by a strategy of cut off branch metabolic pathways and overexpression thr operon in E.coli ITHR. The metA and ilvA genes were knocked out by Red-recombination systems and E.coli ITHR△metA、ITHR△ilvA and ITHR△metA△ilvA were constructed respectively. The pWYE065 containing thr operon were transformed into three mutant strains by electroporation. Red-batch cultures of genetic engineering strains were carried out in 5 L fermentors and the threonine concentration was determined by HPLC. The results showed that E.coli ITHR carrying pWYE065 could accumulated 5.55±0.51 g/L threonine. When metA and ilvA were knocked out respectively, the threonine productions reached 9.77±1.83 g/L and 8.65±1.42 g/L. Both metA and ilvA were knocked out simultaneously, the L-threonine production were increased to 13.6±1.14 g/L. The productivity of L-threonine by E.coli ITHR can be enhanced through the knocking out the gene of the key enzymes in branch metabolic pathways, including the methionine and isoleucine synthesis pathway.

Key words: E.coli    Red recombination    Gene knockout    L-Threonine    Fermentation
收稿日期: 2009-09-23 出版日期: 2010-03-25
基金资助:

国家“863”计划(2006AA02Z216)资助项目

通讯作者: 温廷益     E-mail: wenty@im.ac.cn
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闫继爱
张雪
张芸
左佃光
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温廷益

引用本文:

闫继爱 张雪 张芸 左佃光 陈宁 温廷益. 利用Red同源重组技术构建产L-苏氨酸的基因工程菌[J]. 中国生物工程杂志, 2010, 30(03): 79-84.

YAN Ji-Ai, ZHANG Xue, ZHANG Yun, ZUO Dian-Guang, CHEN Ning, WEN Ting-Yi. Construction of Genetic Engineering Strains for L-threonine Production by Red Recombination. China Biotechnology, 2010, 30(03): 79-84.

链接本文:

https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/        https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/Y2010/V30/I03/79

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