目的: 探究趋化因子受体CX3CR1调控人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的作用和机制,为钙化性主动脉瓣膜疾病的早期干预和治疗提供新思路。 方法: 取非钙化主动脉瓣(3例)和钙化主动脉瓣(5例),免疫组织化学染色检测成骨相关转录因子Runx2、骨桥蛋白OPN和骨钙蛋白OCN的表达;取3例非钙化的主动脉瓣,采用胶原酶连续消化法分离人主动脉瓣膜间质细胞,观察细胞形态及生长状态,并采用细胞免疫荧光进行表型鉴定。对成骨诱导培养的人主动脉瓣膜间质细胞分别过表达和干扰趋化因子受体CX3CR1,平行设置CM组、OM组和negative control+OM组,采用qPCR和Western blot检测Runx2、OPN和OCN的表达,Western blot检测AKT和p-AKT的表达。茜素红S染色评价晚期钙结节形成情况。 结果: 临床标本显示钙化的主动脉瓣较非钙化的主动脉瓣高表达CX3CR1(P<0.05);成功分离人主动脉瓣膜间质细胞,α-SMA和Vimentin阳性,vWF阴性。与CM、OM、negative control组比较,CX3CR1+OM组Runx2、OPN和p-AKT表达上调(P<0.05),且茜素红S染色可见明显钙结节;与CM、OM、negative siRNA control+OM组比较,siCX3CR1+OM组Runx2、OPN和p-AKT表达下调(P<0.05),且茜素红S染色可见钙结节减少。 结论: 趋化因子受体CX3CR1可能通过AKT信号通路促进人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化。
目的: 利用昆虫-杆状表达系统建立表达和纯化分泌形式的水痘-带状疱疹病毒 (varicella-zoster virus, VZV) 糖蛋白gE的方法,并鉴定其理化性质及免疫原性。 方法: 利用Gibson assembly同源重组试剂盒快速构建重组质粒 pFastbac-VZV gE。在sf9昆虫细胞中鉴定序列优化前后表达量的差异,并在High Five TM细胞中大量表达。通过Ni-NTA亲和层析方法得到高纯度gE蛋白,之后通过酶联免疫吸附试验等验证了其理化性质,并进行小鼠免疫分析其免疫原性。 结果: 构建了pFastbac-VZV gE1/2重组质粒,经过PCR及双酶切鉴定后均为阳性克隆。使用BAC/PAC试剂盒提取Bacmid转染sf9细胞制备杆状病毒,经Western blot检测,sf9细胞开始表达gE蛋白且随着病毒代次升高gE蛋白表达量增加。序列优化后表达量明显增加,但是大部分以胞内形式存在。通过Ni-NTA一步亲和层析获得纯度较高的gE蛋白,并与VZV单抗9C8具有较好的反应性。通过免疫小鼠产生高滴度抗体,且免疫荧光结果显示其血清可以与天然病毒上的gE抗原结合。 结论: 成功获得了杆状表达系统表达的gE蛋白并且纯化和鉴定了蛋白质的性质及免疫原性,为进一步研发具有自主产权的VZV亚单位疫苗研究奠定了基础。
环磷酸腺苷(cAMP)在微生物细胞内由ATP直接环化形成,而ATP的合成需要能量与前体的持续供应。通过添加次黄嘌呤激活补救途径,促进了cAMP的合成,与对照批次相比生产效率提高了39.1%,但发酵进行至51h产物不再生成,而且产量未能得到提高。偶合添加次黄嘌呤和2g/L-broth六聚偏磷酸钠发酵批次的cAMP产量达到7.24g/L,比单独添加次黄嘌呤和六聚偏磷酸钠的批次产量分别提高了125.5%和93.5%,生产效率也显著提高,达到了0.101g/(L·h)。六聚偏磷酸钠和次黄嘌呤偶合添加工艺将低聚磷酸盐和补救途径的优势相结合,有效促进了cAMP合成与积累。
为了研究强抗逆植物沙冬青AmNAC3转录因子基因在抗旱性和抗寒性中的功能,首先利用半定量RT-PCR方法对该基因进行了表达分析。结果表明,在室内培养的沙冬青幼苗中,AmNAC3有一定量的基础表达,在干旱胁迫下其转录水平明显上调,而在低温胁迫下其表达上调较弱。然后利用5'RACE技术获得该基因的5'端序列及全长cDNA序列,并利用RT-PCR方法克隆到其全长编码区(846bp)。将编码区片段构建到植物表达载体上,利用农杆菌介导法获得转基因拟南芥。进一步分析表明,转基因拟南芥对于干旱和低温胁迫的抗性表型与野生型无明显差异,但其离体叶片的失水率和气孔开度均大于野生型。此外,转基因幼苗中气孔开闭相关基因ABI1和ABI2的表达量降低。这些结果表明,AmNAC3可能主要在响应干旱胁迫和调节气孔开闭及叶片保水性中发挥功能,而在抵抗低温胁迫中无明显作用。
目的: 构建抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体并制备和验证抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器模型。方法: 利用PCR法扩增出抗人p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26的重链基因H和轻链基因L,然后分别将嵌合抗体重链基因H和嵌合抗体轻链基因L连接到乳腺特异性表达质粒pBC1,从而构建抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L。分别将抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26乳腺特异表达载体pBC1-H和pBC1-L线性化,然后使用原核显微共注射法获得8只转基因FVB小鼠,通过鼠尾直接PCR鉴定其转基因阳性。通过RT-PCR、荧光定量PCR鉴定转基因小鼠乳腺组织中抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26的mRNA表达。使用小鼠乳汁采集器收集其乳汁并通过Western blot和夹心ELISA等实验鉴定抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26是否获得表达。结果: 经测序验证,抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26的嵌合重链基因H和嵌合轻链基因L分别与乳腺特异表达质粒pBC1正确正向连接。鼠尾直接PCR结果显示所获8只转基因FVB小鼠均为转基因双阳性小鼠,且抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26的重链基因H和轻链基因L在它们的后代中稳定遗传,它们的后代中转基因小鼠双阳性率约为30%;RT-PCR和荧光定量PCR的结果显示,转基因双阳性小鼠及其双阳性后代的乳腺组织中存在抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26的mRNA表达;Western blot和ELISA等实验结果显示,转基因双阳性小鼠乳汁中存在抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26的蛋白质表达,而且抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26与羊抗人κ链抗体和羊抗人IgG Fc-HRP抗体均能特异性结合。结论: 成功构建抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L和制备了抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器模型,为今后抗p185 erb B2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因牛乳腺生物反应器的研究奠定了理论和技术基础。
为在研究工作中提高制作目标基因多位点突变体的效率,对常规重叠延伸PCR进行适当改进:对于相距较近的两个突变位点,只需设计一对突变引物各自涵盖其中一个位点即可一次突变;对于相距较远的两个位点,可以采用三片段重叠延伸PCR的办法解决;两者结合则可一次性突变多个位点。以制作RBCT的6位点突变体PSM6为例,利用上述策略,设计两对突变引物;采用OE-PCR法,第一轮PCR扩增出三个片段,第二轮PCR同时利用三片段重叠延伸产物作为模板扩增出目标基因突变体,再按常规分子克隆方法将其连入质粒载体。经测序检测,发现得到了预期的目标基因多位点突变体。因此,采用灵活的引物设计策略,结合多片段重叠延伸PCR即可一次性制作基因的多位点突变体,此方案可解决研究工作中大多数多位点突变问题。
酮还原酶CgKR2能够一步还原前手性羰基化合物生成高附加值的手性醇,有望解决手性醇传统制备方法的步骤烦琐和高成本问题,具有很高的经济效益。研究表明,CgKR2催化底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)生成普利类降压药的重要中间体(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯[(R)-HPBE]具有良好效果。但CgKR2的生产成本高昂、过程烦琐。利用短短芽孢杆菌胞外分泌表达酮还原酶CgKR2,获得该酶的高效表达,并经简便的一步镍亲和层析纯化,即获得高纯度酮还原酶CgKR2,产率高达每升发酵7.8mg纯酶。以酶标板法测定其比活力、温度稳定性以及动力学参数等基本酶学性质,结果显示,CgKR2的比活力为(78.32±7.62)U/mg、Km为(0.2±0.02)mmol/L、Vmax为(117.64±3.6)μmol/(min·mg)、Kcat为73s -1,与以往报道的数据一致,并且获得的CgKR2纯酶在30℃下孵育72h依然保持80%的活性,酶活的稳定性远好于以往的制备方法。开发出的一套简便高效的酮还原酶CgKR2表达纯化工艺,降低了生产成本、简化了生产工艺,可推进手性醇生物催化制备的普及,对其他生物催化工程酶的制备方法研究也有借鉴作用。
以保加利亚乳杆菌Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CICC21101为出发菌株,利用PCR扩增L-乳酸脱氢酶(ldhL)基因上下游序列ldhL1、ldhL2,获得ldhL基因缺失且包含上下游序列的片段,连接到乳酸菌专用温敏性基因敲除质粒pGhost4,将构建好的敲除载体电转入保加利亚乳杆菌CICC21101,低温筛选。结果表明,成功获得敲除ldhL基因的敲除突变株,敲除后的工程菌D-乳酸产量由30.5g/L降为4.8g/L,L-乳酸的产量由25.4g/L增至58.3g/L,光学纯度由54.56%增至90%。同时发现ldhL-ldb0094基因的敲除致使ldhL-ldb1020表达的上调,D-乳酸脱氢酶(ldbD)基因表达量没有变化,ldhL基因敲除株的成功构建将为进一步研究该基因在保加利亚乳杆菌中的功能及后续高光学活性D-乳酸工程菌构建奠定基础。
外泌体是细胞内源性囊泡样生物纳米级膜结构,直径大小在40~100 nm之间,可由各种类型的细胞分泌释放。外泌体具有许多功能,如蛋白质、mRNA、miRNA和脂类的细胞间运输和传递,以及抗原递呈,还可能具有致癌的能力。肿瘤细胞所分泌释放的外泌体在肿瘤的发生、发展以及迁移等生理和病理过程中发挥重要的作用。目前从肿瘤外泌体中寻找特异性标志物已成为肿瘤研究者重点关注的方向,对肿瘤早期诊断、疗效评价和预后分析具有重要的意义。就近年来外泌体在肿瘤研究和诊断中的研究进展进行了综述。
KLF8(Krüppel-like factor 8)是Krüppel 样转录因子家族最新成员。KLF8广泛表达于皮肤、脂肪、食道等组织中。早期研究表明,KLF8蛋白具有转录抑制活性,在胚胎发育过程中起重要作用。而近些年大量的研究发现KLF8在多种肿瘤组织中异常高表达,具有转录活化因子活性,可通过对细胞增殖、迁移、侵袭、EMT、细胞干性等多项生理过程调控促进肿瘤发生发展。综述了近年来KLF8研究进展,系统阐述了KLF8表达修饰调控及致瘤机制,为全面深入了解KLF8在肿瘤中作用及后续相关研究提供参考。
抗菌肽(AMPs)广泛存在于生物体内,可以协助机体抵御外源微生物的侵害,是生物体先天性防御系统中的重要组成成分。普遍认为,抗菌肽通过膜损伤机制,破坏微生物细胞膜或细胞壁的完整性,达到抑杀微生物的目的。然而,越来越多的证据表明抗菌肽还存在非膜损伤机制,作用于胞内靶位点杀伤细胞。由于其独特的作用机制及广谱抗菌活性,抗菌肽被应用于各行各业。但是,抗菌肽的推广应用也面临着诸多难题,如生物稳定性、抗菌活性的维持和微生物耐受性等。主要对抗菌肽的种类、作用机制、微生物对抗菌肽耐受性的产生机制及抗菌肽的应用和挑战进行综述。
在单克隆抗体药生产过程中,其糖基化修饰可能受到多种工艺参数的影响,因而容易产生异质性,并且抗体糖基化和抗体半衰期、免疫源性、ADCC、CDC等密切相关,所以单克隆抗体的糖基化修饰是重要的质量属性,需要在生物药尤其是生物类似药开发过程中重点关注,并加以调控。通过概述培养过程中的细胞株、培养工艺,以及培养基对糖型的影响,讨论如何在工艺开发过程开展研究,确保产品糖基化的一致性,从而保证单抗药物的疗效及安全性。
石莼多糖(Ulvan)由3-硫酸化鼠李糖,葡糖醛酸,艾杜糖醛酸及一些随机分布的木糖组成。石莼多糖及其降解得到的寡糖在医疗、食品等领域具有广泛的应用前景。为促进对石莼多糖裂解酶这一石莼多糖利用工具的开发,对石莼多糖裂解酶的底物组成,来源分类,序列及进化关系,酶学性质及作用模式,蛋白结构以及作用机制进行了综述,以求对后续石莼多糖裂解酶研究者提供帮助。
