2017年, 第37卷, 第6期 
刊出日期:2017-06-25
  

  • 全选
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    研究报告
  • 袁雅红, 赵珊珊, 王小莉, 腾智平, 李东升, 曾毅
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 1-8. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170601
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    目的:通过研究人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) Tat蛋白对骨髓间充质干细胞(BMSC)造血支持功能的影响,进一步揭示HIV-1感染者造血损伤的机理。方法:原代培养BMSC,流式检测其表面标志,诱导分化鉴定其多向分化潜能;免疫磁珠分选造血干细胞(HSC),流式检测其纯度;HIV-1 Tat蛋白添加到培养基中培养20天的BMSC(BMSCTat)与对照BMSC (BMSCCon)分别作为滋养层与HSC分6组进行共培养,随后计数各组造血细胞总数,诱导分化检测造血细胞集落形成能力;RT-PCR检测BMSCTat和BMSCCon造血相关因子mRNA的表达强度,ELISA检测BMSCTat和BMSCCon条件培养液中造血相关因子GM-CSF及IL-6的浓度。结果:经鉴定成功培养获得原代BMSC;免疫磁珠分选的HSC纯度可达95%以上;分6组共培养进行比较,以BMSCTat为滋养层培养的造血细胞总数及造血细胞形成的集落总数均明显少于以BMSCCon为滋养层;BMSCTat的造血相关因子的mRNA的表达明显弱于BMSCCon,BMSCTat的条件培养液中GM-CSF和IL-6的浓度均明显低于BMSCCon。结论:HIV-1 Tat蛋白对BMSC的造血支持功能有明显的抑制作用。
  • 秦瑞坪, 李玲霞, 马晓玲, 席欧彦, 赵婷, 邱玲玲, 李江伟
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 9-16. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170602
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    近年来,卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)在骨质疏松中的作用得到了证实。卵泡刺激素受体(FSH receptor,FSHR)在成熟的人破骨细胞及破骨细胞前体即单核细胞表面表达,成为阻断FSH 作用的潜在靶点。制备了高滴度的兔抗人FSHR 多克隆抗体,采用双侧去卵巢手术方法建立SD (Sprague-Dawley)大鼠骨质疏松症动物模型,观察抗FSHR抗体对大鼠实验骨质疏松症的治疗效果。结果显示,卵巢摘除(ovariectomized,OVX)大鼠经抗FSHR多抗和亮丙瑞林(leuprorelin,LE)治疗两周后,与PBS对照组相比,血清FSH和黄体酮(luteinizing hormone,LH)水平显著降低(P<0.05), 而雌二醇(estrogen,E2)水平有一定升高,但结果不显著(P>0.05)。另外,骨组织化学染色显示多抗和LE治疗组大鼠骨小梁数目增加,断裂现象较少。这些结果初步表明,采用抗FSHR抗体对SD 大鼠骨质疏松症具有一定的治疗作用。
  • 徐安健, 李艳萌, 李斯文, 乌姗娜, 张蓓, 黄坚
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 17-21. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170603
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    目的:获取人组氨酸磷酸酶蛋白PHPT1基因,并构建其C端GFP融合的真核表达载体,通过瞬时转染观察融合蛋白在细胞内的表达和定位,并研究其定位与细胞层状伪足形成的关系。方法:以人宫颈癌细胞株HeLa cDNA为模板,PCR扩增PHPT1的全长编码基因,克隆到pEGFP-N2载体中,构建pEGFP-N2-PHPT1真核表达载体,利用脂质体将构建的载体转染到HeLa细胞中,用激光共聚焦扫描显微镜观察C端GFP连接的PHPT1的细胞定位,并进一步探讨其定位与细胞层状伪足形成的关系。结果:成功构建了PHPT1的GFP融合表达载体pEGFP-N2-PHPT1,并在HeLa细胞中检测到了融合蛋白的表达,发现其定位与细胞层状伪足的形成密切相关,并可直接影响细胞的运动能力。结论:GFP融合形式表达的PHPT1蛋白在细胞质和细胞核中均有表达,并且定位于细胞层状伪足的前沿,影响细胞层状伪足的形成,从而影响细胞运动。
  • 范梦恬, 陈思成, 郭杨柳, 李亚, 孙艳婷, 李汪, 施琼
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 22-30. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170604
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    目的:探究趋化因子受体CX3CR1(C-X3-C motif chemokine receptor 1,CX3CR1)对人肝癌细胞7721和HepG2增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法:采用Q-PCR和Western blot法分别检测人正常肝细胞LO2和两种肝癌细胞(7721和HepG2)中CX3CR1的基因表达情况(mRNA和蛋白质);以过表达CX3CR1的质粒转染7721细胞,用抑制CX3CR1的干扰RNA转染HepG2细胞,通过Q-PCR和Western blot法检测CX3CR1的变化;应用MTT和流式细胞实验检测各组细胞的增殖能力;用集落形成实验检测各组细胞的自我更新和增殖能力;借助划痕愈合和Transwell检测各组细胞的迁移和侵袭能力;利用Western blot法检测PI3K/AKT、MAPK/ERK信号通路的激活情况。结果:CX3CR1在7721细胞中mRNA和蛋白质呈低表达趋势,而在HepG2细胞中则呈高表达趋势;转染过表达CX3CR1质粒后7721细胞中CX3CR1的mRNA和蛋白水平有明显的升高,细胞的增殖、迁移、侵袭能力增强,p-AKT和p-ERK水平升高;转染干扰RNA后HepG2细胞中的CX3CR1表达水平明显下降,增殖、迁移、侵袭能力减弱,p-AKT和p-ERK水平降低。结论:趋化因子受体CX3CR1可以促进人肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,该作用可能与PI3K/AKT、MAPK/ERK信号通路激活有关。
  • 秦瑶, 赵鸿彦, 张文航, 王冬梅
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 31-36. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170605
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    目的:探讨miR146a参与多柔比星心肌细胞毒性作用的可能机制。方法:用多柔比星处理大鼠心肌细胞,用CCK-8方法检测细胞活力,用荧光定量PCR检测miR146a的变化,用Western blot检测切割的Caspase 3的蛋白变化。使用常间回文重复序列丛集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的方法,设计针对miR146a的向导RNA,敲除miR146a的表达。用CCK-8方法和Western blot分别检测敲除细胞的活力和Caspase 3蛋白变化。用软件预测miR146a的靶基因,利用荧光素酶系统进行验证。用Western blot检测多柔比星处理后靶基因的变化,以及用Western blot检测敲除miR146a对靶基因变化的影响。结果:多柔比星处理导致大鼠心肌细胞活力降低,切割的Caspase 3水平升高,同时发现miR146a表达升高(3.6倍)。使用CRISPR可有效敲除miR146a的表达,敲除效果显著高于microRNA decoy的效果(88.6% vs 57.6%)。敲除miR146a的细胞用多柔比星处理,miR146a增加不明显(1.08倍),并且敲除miR146a抑制了多柔比星导致的细胞活力降低和Caspase 3升高。经生物信息学及荧光素酶检测证实在大鼠心肌细胞内Smad family member 4(Smad4)是miR146a的靶基因,用多柔比星处理心肌细胞后,Smad4的表达降低。而敲除miR146a后,Smad4的表达升高,用多柔比星处理敲除miR146a的细胞,Smad4的表达变化不明显。结论:大鼠心肌细胞中,miR146a通过调节Smad4的表达参与了多柔比星对细胞的毒性作用。
  • 李艳伟, 马义, 韩磊, 肖兴, 党诗莹, 文涛, 王得华, 范志勇
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 37-42. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170606
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    利用肥胖患者血液和肥胖动物模型研究Fas凋亡抑制分子FAIM 1与单纯性肥胖的关系,为揭示单纯性肥胖发生的分子机理和诊治肥胖提供新的实验基础。检测40例单纯性肥胖患者和17例正常者血液白细胞的FAIM 1蛋白的表达量,分析FAIM 1与单纯性肥胖的相关性。为进一步揭示FAIM 1与单纯性肥胖发生、发展的内在关系,利用高脂饲料建立肥胖模型,并测定肥胖组和对照组大鼠的体重和血糖水平;造模成功的肥胖组大鼠和对照组大鼠禁食12h,麻醉心脏取血,分析血脂中总胆固醇(TC)、甘油三酯 (TG)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)的变化;取肥胖组和对照组大鼠的附睾脂肪垫和肾周脂肪,分析重量变化;取肥胖组和对照组大鼠,利用Western-blot 检测FAIM 1及胰岛素受体β(IR β)的表达变化。实验结果表明:与正常者相比,单纯性肥胖患者血液白细胞的FAIM 1表达量平均减少36.4%;与对照组相比,肥胖组大鼠血清TC、TG和LDL-C分别增加37.1%、25.6%和39.1%,而HDL-C则降低33.3%;肥胖组大鼠附睾脂肪垫和肾周脂肪分别是对照组的1.85倍和2.24倍;与对照组相比,肥胖组大鼠肝脏FAIM 1、IRβ的表达量分别降低45.9%和32.6%,与临床血液样本的检测结果一致。研究表明,FAIM 1表达与单纯性肥胖发生具有显著的负相关性,FAIM 1可成为单纯性肥胖诊断和治疗的新靶点。
  • 张玉富, 王建文, 李松涛, 朱张亮, 路福平, 毛淑红, 秦慧民
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 43-49. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170607
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    胆固醇氧化酶是胆固醇代谢过程中的关键酶,临床上用胆固醇氧化酶作为检测血清胆固醇含量的应用潜力巨大。将来源于红球菌Rhodococcus ruber的胆固醇氧化酶ChOG,分别转化到大肠杆菌宿主BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中,在不同条件下进行诱导表达,结果表明:BL21(DE3)菌株在诱导温度为16℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L时,ChOG可溶性表达量最高 (0.49 mg/ml)。ChOG的最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.5。最适反应条件下,酶活性达到8.0 U/mg。利用TLC、HPLC对ChOG催化产物胆甾-4-烯-3-酮进行了鉴定分析。三维结构及定点突变分析表明Glu406及Arg408、Glu261在进行胆固醇C3羟基的脱氢、质子传递,以及底物异构化方面发挥着重要作用。
  • 夏惠, 刘磊, 王秀, 沈妍秋, 郭雨伦, 梁东
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 50-55. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170608
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    为研究6-磷酸山梨醇脱氢酶(sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)基因启动子(S6PDHp)的逆境诱导表达特性,利用Gateway技术构建了S6PDH基因启动子区 5'端系列缺失体与GUS基因的融合表达载体,并通过农杆菌介导法转化拟南芥。对转基因拟南芥进行低温和外源ABA处理,通过GUS蛋白活性变化分析S6PDHp的逆境诱导表达特性。研究结果发现,通过Gateway技术构建了4个S6PDHp 5'端系列缺失体与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的融合表达载体(pGWB433-S6PDHp1、pGWB433-S6PDHp2、pGWB433-S6PDHp3和pGWB433-S6PDHp4)并获得了相应的转基因拟南芥。对转基因植株进行低温处理后发现,pGWB433-S6PDHp3转基因植株中的GUS活性增幅最大,达到显著水平,而其他转基因植株中的GUS活性基本保持不变。外源ABA处理后发现,除pGWB433-S6PDHp4外,其余启动子缺失体转基因拟南芥中GUS活性显著升高。以上结果表明,低温和外源ABA能够诱导S6PDHp的表达,但不同的缺失体响应程度不同,意味着在S6PDHp序列(-2 396bp至-236bp)中可能存在着响应逆境胁迫的正负调控顺式作用元件。
  • 巨晓芝, 袁倩倩, 马春玲, 肖冬光, 马红武
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 56-62. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170609
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    乙酰CoA是生物体代谢过程中重要的代谢物,也是许多有价值产品合成的前体物质。然而传统途径中通过丙酮酸脱羧生成乙酰CoA碳得率较低,因此构建一条高效的乙酰CoA合成途径具有重要的意义。由于在体外验证文献报道的高碳摩尔得率合成乙酰CoA的苏氨酸循环固碳途径,有较重要的理论意义和应用价值。因此在体外构建了苏氨酸循环固碳途径合成乙酰CoA,通过分段加酶的方式将其在体外进行了验证。在体外验证时,以丙酮酸为底物,则丝氨酸脱氨酶(TdcB)为循环途径的最后一步反应。结果表明,当加入途径中除丝氨酸脱氨酶之外的酶时,测得的乙酰CoA浓度约1.5 mmol/L,待反应达到平衡时,加入丝氨酸脱氨酶,丝氨酸转化为丙酮酸,丙酮酸再次进入循环,乙酰CoA的量增加了约0.2 mmol/L,由此得出结论在体外苏氨酸循环实现了固碳。
  • 技术与方法
  • 王丹丹, 陈恬, 许亮国
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 63-69. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170610
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    病原微生物感染对人类健康构成巨大威胁,先天免疫系统是生物体在长期进化过程中建立起来的天然保护系统。VISA(MAVS,CARDIF,IPS-1 )是连接胞浆dsRNA受体RIG-I与下游信号转导通路的一个接头蛋白,研究结果表明VISA无论在TLR3非依赖的或者TLR3介导的抗病毒IFN信号途径中都具有关键作用,但目前对VISA信号转导的详细机制还不十分清楚。更多VISA相互作用蛋白的发现以及它们之间的作用机制的研究能完善我们对VISA参与的信号转导机制的认识。利用酵母双杂交系统,用VISA蛋白的全长做诱饵(Bait)筛选293 T细胞cDNA表达文库,并结合免疫共沉淀实验,双荧光素酶报告基因系统验证筛选到的阳性克隆和VISA作用的真实性。通过酵母双杂交系统成功筛选到 Sec13L1 候选基因并验证了其与VISA的全长蛋白相互作用,在293 T细胞中过表达该基因,研究结果显示 Sec13L1 过表达能促进VISA对IFNβ的诱导,并存在剂量效应。
  • 李阳, 吴酬飞, 吴小芹, 叶建仁, 张立钦
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 70-77. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170611
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    人工合成优化 Cry3a 杀虫蛋白基因,并从大肠杆菌BL21(DE3)中克隆T7表达系统,通过同源重组克隆进PHKT2表达载体,将此表达载体导入吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007,通过诱导表达,成功指导合成T7 RNA聚合酶且高效表达分子量为70kDa的 Cry3a 蛋白。通过粗提液对二龄榆蓝叶甲进行生物毒杀试验,结果表明粗提液具有高毒性,致死中浓度(LC50=0.63(0.48-0.82) g/L)。成功构建的T7表达系统,可高效表达毒性的 Cry3Aa 蛋白,为进一步开发杀虫生防菌剂,建立外源基因表达技术平台奠定了基础。

  • 杨建伟, 薛正莲, 朱昊, 杨蒙, 王洲
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 78-85. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170612
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    利用常压室温等离子体诱变技术(ARTP)处理磷脂酶A1重组质粒 pET28a-plaB,经琼脂糖凝胶电泳检测发现随着处理时间的延长,质粒超螺旋结构逐渐转变为开环及线性结构。对处理后的质粒转化到BL21宿主菌中,在特定选择培养基中检出突变株转化子,结果表明,质粒处理时间与转化率成反比,与突变率成正比,在60 S达到最优诱变值。挑选圈径比较大的转化子测定其酶活,结果显示突变株(12)最高酶活为12.8 U/ml,与原始菌株(CK)4.8 U/ml相比,提高了2.67倍。对两菌株测序比对,发现碱基突变率为0.74%,且大都集中在A→G和C→T。ARTP对离体质粒具有较好的诱变效应。
  • 窦一涵, 李映, 赵鹏, 范如婷, 田平芳
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 86-92. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170613
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    聚3-羟基丙酸 是一种生物可降解及生物相容的新型聚羟基脂肪酸酯。目前已鉴定的生物均不能天然合成P3HP。采用PCR克隆鼠伤寒沙门氏菌的丙醛脱氢酶(PduP)基因及罗尔斯通氏菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶(PhaC)基因,构建共表达载体,转化肺炎克雷伯氏菌后获得两株重组菌。以甘油为唯一碳源进行摇瓶发酵,pduP和phaC共用tac启动子的工程菌K. p(pET-tac-pduP-phaC)产生0.054 g/L的P3HP,而pduP和phaC各自独用tac启动子的工程菌K. p(pET-tac-pduP-tac-phaC) 产生0.091 g/L的P3HP。
  • 综述
  • 赵治国, 崔强, 赵林立, 王海艳, 李刚, 刘来俊, 敖威华, 马彩霞
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 93-96. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170614
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    微滴数字 PCR 技术是数字PCR技术的一种,是近年来分子生物学领域的新型革命性技术,其特点是高度灵敏、绝对定量及高效方便等。目前,该技术在微生物检测、转基因检测、疾病检测以及质检领域的研究和应用中已凸显优势,随着微滴数字 PCR 仪的普及,该技术必将广泛应用于生命科学的各个领域。
  • 赵秀丽, 周丹丹, 闫晓光, 吴昊, 财音青格乐, 李艳妮, 乔建军
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 97-106. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170615
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    细菌代谢工程需要优化基因的表达来平衡代谢物通量分布和减少有毒的中间体积累,从而提高产物生物合成。细菌小RNA(small RNA,sRNAs)与靶标mRNA通过碱基互补配对结合来抑制或激活其靶标基因的表达。sRNA在细菌的生理过程中都起到了至关重要的调控作用,因此被认为是细菌代谢工程中调节靶标基因表达的有力工具。近年来,越来越多的人工合成sRNA在细菌代谢工程中得到应用,分别就细菌sRNA的靶标识别和其对靶标的调控及代谢工程中的应用做了总结概括。
  • 李莉莉, 魏琦岩, 王艳芳, 何忠梅, 郜玉刚, 马吉胜
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 107-113. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170616
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    不管是在胚胎骨骼形成还是出生后骨骼发育过程中,FGF/FGFR信号都发挥着重要的作用,成骨细胞在骨骼形成过程中起主导作用,成骨细胞不断地分化是骨骼形成的必要条件,FGF/FGFR信号可调控成骨细胞分化过程中不同标志性基因的表达。该信号不仅可以通过自身作用于成骨细胞分化,而且也可与其他信号通路(BMP,Wnt和PTH)相互作用,共同协调控制成骨细胞分化。FGFR突变会引起成骨细胞分化异常从而出现各种骨疾病,如颅缝早闭,骨质疏松,异位骨化等。现对FGF及FGFR家族,成骨细胞分化过程中标志性基因及相应的标志物,FGF/FGFR信号调控成骨细胞分化作用等方面进行综述。
  • 徐媛媛, 俞翰炳, 吴飞华, 吴晓梅
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 114-123. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170617
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    林木的分子病理学研究长期以来落后于农业作物病理学。随着高通量测序技术的问世,林木的分子病理学研究迎来了一个崭新的时代。从2006年至今,杨树、云杉等重要森林树种的全基因组测序相继完成,这为全面解析林木的抗病过程提供了遗传背景。同时,转录组学和全基因组关联分析的应用使得人们能快速地积累大量的数据,从而为揭示林木和病原菌之间的分子互作机制奠定了基础。近两年来CRISPR/Cas9基因编辑等分子生物学技术创新不断。高效的分子生物学技术结合基因组学研究有利于林木育种的研究。以下阐述了林木对抗病原菌入侵的生理机制,综合论述了近十年来基因组学和转录组学研究在木本植物分子病理学方面所取得的成果,总结了分子生物学技术在林木抗病领域的研究成果,分析了存在的问题和未来发展的趋势,以期为林木抗病育种提供参考。
  • 马泽林, 刘家亨, 黄序, 财音青格乐, 朱宏吉
    中国生物工程杂志. 2017, 37(6): 124-133. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170618
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    木质纤维素原料是世界上最为丰富的资源之一,可用作微生物发酵生产高附加值生物化学品的原料。与传统用于微生物发酵的可食用生物质原料相比,目前微生物利用木质纤维素还存在以下几个关键问题:开发经济有效的木质纤维素预处理工艺、提高微生物对木质纤维素水解液中第二大单糖木糖的有效利用水平、增强微生物对木质纤维素水解液中混糖的综合利用能力以及提高微生物对木质纤维素水解液中糠醛、乙酸等发酵抑制物的耐受能力。综述了近年来国内外针对这几个关键问题的最新研究成果。为今后微生物大规模利用木质纤维素进行商业生产提出了展望和建议。