2017年, 第37卷, 第11期　
刊出日期：2017-11-15

  

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计算生物学与生物信息学专栏
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  应用高通量测序技术对蚊携带RNA病毒的检测研究

  王慧煜, 何鮦鮦, 刘佳佳, 范航, 宋锋林, 梅琳, 童贻刚, 韩雪清

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 1-5. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171101

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  目的：基于高通量测序技术，分析我国不同边境地区蚊虫携带病原的多样性，为快速筛查蚊媒病原提供参考依据。方法：将采自不同边境地区的田间样品随机分为6组，提取病毒核酸，然后使用Ion S5 XL测序仪进行高通量测序，并进行生物信息学分析。结果：在6个蚊类混合样本中，有4个混合样本发现2种及2种以上的可疑病毒。结论：高通量测序检测体系有效地检测出蚊媒病毒的存在，初步揭示了蚊类所携带的病原体种类的多样性。
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  肠道菌群核酸提取自动化流程的优化

  李金蔓, 裴广倩, 范航, 黄勇, 童贻刚

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 6-11. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171102

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  目的：优化肠道菌群核酸提取自动化流程。方法：收集粪便样本，分别采用手工方法、核酸提取工作站提取核酸，然后利用液体工作站制备PCR反应液进行PCR扩增，最后采用文库工作站建库测序。结果：400μl样品用QIAamp^® Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒裂解液裂解后，用MagMAX^TM Express 96机器提取核酸的方法与用QIAamp^® Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒手工提取核酸的方法相比，测序得到的序列数基本一致，分析结果也没有明显区别；而单独采用MagMAX^TMViral RNA Isolation Kit试剂盒提取核酸由于样品投入体积受限（50μl）、核酸浓度低、测序得到的序列数太少，不能满足后续的分析要求。结论：通过结合使用两种不同的试剂盒，可以实现核酸提取、PCR反应液配制及文库制备的全流程自动化操作，从而大大提高工作效率和结果的稳定性。
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  DNA提取对微生物多样性测序分析的影响

  安云鹤, 程小艳, 田彦捷, 马凯, 高丽娟, 武会娟

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 12-18. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171103

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  运用高通量测序技术分析复杂样品中微生物种群的变化情况，已经成为目前微生物研究领域的热点问题之一。而微生物的样品准备，如DNA提取和16S可变区的扩增等，对于测序完成后的数据分析以及微生物原始群落组成的影响是至关重要的。采用国产试剂盒（天根土壤微生物基因组提取试剂盒）和进口试剂盒（MOBIO土壤微生物基因组提取试剂盒）分别对土壤样品和羊瘤胃食糜样品进行DNA提取。然后选取总DNA起始量为25ng，对16S V3可变区进行PCR扩增和文库构建，最后通过数据分析比较不同试剂盒提取的DNA对微生物多样性变化的影响，包括OTU数目、稀释曲线、微生物数量及物种种类等。研究发现，在相同DNA模板量和PCR条件下，进口试剂盒提取的DNA能够获得更多的微生物种类。
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  昆虫脂肪酸合成通路关键基因的研究进展

  郑天祥, 钱雨农, 张大羽

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 19-27. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171104

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  脂肪酸对昆虫生长、发育、繁殖、信息交流起到重要的作用。主要介绍脂肪酸合成通路中的5个关键基因，乙酰辅酶A羧化酶基因（ACC）、脂肪酸合成酶基因（FAS）、超长链脂肪酸延伸酶基因（ELO）、去饱和酶基因（desat）及脂酰辅酶A还原酶基因（FAR）在昆虫中的研究进展。
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  建设适应重庆地区的区域医学影像信息和大数据分析平台

  肖铭, 陈平, 何鸿谕, 章乐

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 28-36. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171105

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  由于重庆地区的医疗水平参差不齐，所以建设重庆地区区域医疗影像信息化系统，实现各类影像信息共享，对提供高效的医疗卫生服务具有非常重要的意义。目前，建设重庆地区区域医疗影像交互平台面临着整体设计集成程度和扩展性不高、医学影像标准不统一、数据安全与质量标准不完整、平台没有整合大数据分析挖掘方法等问题。为此，首先对重庆地区区域影像平台的整体结构进行了设计，提出了区域影像交互平台的五层体系结构；其次在五层体系结构基础上制定和加强了影像数据标准和信息安全体系；并且在区域影像中心的基础上，嵌入了医学影像大数据分析工具。应用结果证明，交互平台具有较高的集成程度和扩展性，平台标准的制定和加强能有效的提高交互效率，加强数据安全和质量管理，并且平台可对海量数据进行有效的分析。
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  药用植物保育云服务平台设计与实现

  闫鹏程, 张占江, 裴智勇, 付延婷, 陈禹保, 刘彤

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 37-44. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171106

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  药用植物资源是中医药事业和生物医药产业赖以生存和发展的重要资源，同时也是我国的中医药文化遗产的载体。而药用植物资源的保育工作是药植资源可持续性开发与应用的基础。随着生物信息学与信息化技术的快速发展，利用包括云计算在内的新兴信息化技术，在传统种质资源保护与管理等方面的应用越来越多，然而，在药用植物资源保育方面还有待开发与应用。利用云计算、数据库应用及生物信息学等相关技术，对我国药用植物资源的保育数据进行信息化及平台建设，构建药用植物保育云服务平台系统。该系统通过收集、整理和加工药用植物资源信息，开展药用植物数据信息化与应用开发，完成药用植物保育云服务平台，可提供药用植物保护及新物种培育等方面信息查询服务。该平台对于药用植物研究相关的数据标准化、保育学科研究，以及信息共享与服务，具有较为重要的应用价值与社会意义。
研究报告
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  自组装短肽水凝胶支架三维培养环境对骨髓间充质干细胞生物学特性及心肌方向分化的影响

  赵正德, 陈振银, 张慧楠, 龚剑萍, 许少丹, 罗忠礼

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 45-51. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171107

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  目的：探究短肽GFS-4自组装形成的水凝胶作为支架材料构建三维微环境对BMSCs生物学特性及向心肌细胞方向诱导分化过程的影响。方法：刚果红染色、红细胞膜裂解实验检测短肽GFS-4自组装效果及对细胞膜是否具有裂解作用；CCK8和AO/EB染色分别检测对BMSCs活性和凋亡的影响；Real-time PCR分析BMSCs诱导分化后MLC-2v、GATA-4基因表达情况。结果：GFS-4自组装后形成致密凝胶，自组装前后对细胞膜无损伤；三维培养环境细胞呈球形生长，细胞活力和凋亡速度均低于二维培养环境。三维培养组在诱导分化过程中的第5天和第7天MLC-2v、GATA-4基因表达均显著高于二维组（P<0.05）。结论：短肽GFS-4自组装水凝胶构建的三维微环境延缓了BMSCs的增殖速度和凋亡速度，并促进向心肌方向诱导分化过程中MLC-2v、GATA-4基因的表达。
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  金黄色葡萄球菌arl双组分信号转导系统受体蛋白ArlS_CA的表达、纯化及活性研究

  王路路, 权春善, 许永斌, 陈金利, 吴懿, 王冠天, 董悦生

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 52-58. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171108

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  金黄色葡萄球菌是一类重要的病原菌，其毒力因子的表达及分泌过程由多种双组分信号转导系统（two component signal transduction system，TCSTS）共同调控，其中ArlRS双组分信号转导系统与细菌的生长和分裂密切相关。ArlRS双组份系统的信号传递通过组氨酸激酶ArlS磷酸化实现，ArlS的胞内域被认为是调控毒力因子表达的重要功能域，以ArlS蛋白的胞内域部分即ArlS_CA为目标蛋白进行相关的活性研究。首先，构建pProEX-HTa-arls和pProEX-HTa-arlr重组质粒，对目的蛋白进行诱导表达。其次，利用金属离子螯合层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析方法对目的蛋白进行分离纯化，纯化后的ArlR蛋白纯度可达98%，产量约为25mg/L；纯化后的ArlS蛋白纯度可达90%，产量约为15mg/L。圆二色谱检测结果显示纯化后的目的蛋白有完整的二级结构，体外磷酸化结果显示，ArlS蛋白具有激酶活性，自磷酸化后可以将磷酸基团转移给反应调控蛋白ArlR。最后，利用定点突变的方法，构建了418位和420位氨基酸残基突变的表达载体pProEX-HTa-ArlS_CAG418A和pProEX-HTa-ArlS_CAG420A。ArlS_CAG418A和ArlS_CAG420A蛋白不具有激酶活性，说明418位和420位氨基酸残基在ArlS蛋白的自磷酸过程中起着关键作用。
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  转香蕉MaASR1基因的拟南芥株系在干旱胁迫条件下的表达谱分析

  张丽丽, 徐碧玉, 刘菊华, 贾彩红, 张建斌, 金志强

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 59-73. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171109

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  干旱是最重要的环境胁迫，香蕉MaASR1基因在植物响应逆境胁迫时发挥着重要作用，为了深入研究MaASR1基因的过表达使拟南芥抗旱的分子机制，利用全基因组表达芯片来广谱的筛选MaASR1基因转入后自然条件下及干旱处理条件下差异基因的表达情况。对基因芯片的结果进行了详细的生物信息学分析及相关基因的RT-PCR验证，结果表明MaASR1基因异源表达的拟南芥株系在自然生长条件下共有747个差异基因，其中上调基因559个，下调基因188个；在干旱胁迫条件下共得到653个差异基因，其中上调基因256个，下调基因397个； MaASR1基因的转入可以通过影响激素、光合作用、锌指蛋白及不依赖ABA途径的DREB2A等相关基因的表达来提高拟南芥的抗旱性。为解析MaASR1基因作为转录因子提高植物抗旱能力的分子机制奠定基础。
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  季也蒙毕赤酵母菌尿酸酶基因的克隆、重组表达及表征

  饶菁菁, 景一娴, 邹明月, 胡小蕾, 廖飞, 杨晓兰

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 74-82. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171110

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  目的：克隆一种季也蒙毕赤酵母菌的尿酸酶蛋白编码基因，并通过重组表达和表征进行确认。方法：测定酵母细胞株C.G.M.C.C 2.1008的rRNA序列鉴定其所属种，串联质谱分析此天然尿酸酶肽段序列搜索同源蛋白，测定转录组验证其诱导表达属性，据季也蒙毕赤酵母ATCC 6260基因组信息推断所得尿酸酶（Uniprot id：A5DFP1）的编码序列设计引物，从C.G.M.C.C 2.1008细胞株cDNA中PCR扩增尿酸酶基因，测序后再克隆至定向表达载体pDE1及pDE2中构建带6His标签的重组表达质粒pDE1-MGU和pDE2-MGU，同时构建无6His标签的表达质粒R-MGU。在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达此真菌尿酸酶，SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS测定肽段分子质量，以尿酸为底物测定其动力学参数及抑制剂敏感性等性质，并与天然尿酸酶进行比较。结果：rRNA序列表明此菌株为季也蒙毕赤酵母，串联质谱分析胰蛋白酶解肽段表明此天然真菌尿酸酶与尿酸酶A5DFP1高度相似，转录组测序支持此尿酸酶基因高效诱导表达。用所设计引物经PCR从cDNA快速获得编码序列，T载体测序显示其与A5DFP1编码序列仅在第435位碱基不同但氨基酸仍相同。SDS-PAGE发现重组R-MGU肽段约35kDa；MALDI-TOF-MS发现其肽段约17.43kDa且与天然酶一致，但按氨基酸序列计算分子质量仅为33.98kDa，表明其可能存在化学修饰。重组表达带6His标签尿酸酶纯化后比活性接近6.0U/mg；R-MGU米氏常数、代表抑制剂的抑制常数及分子质量与天然尿酸酶无差别，但R-MGU很难纯化，使其相同条件下的热稳定性比纯化天然酶略差。结论：成功克隆了一种季也蒙毕赤酵母菌的尿酸酶，并实现其活性形式的重组表达。
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  产酸丙酸杆菌耐酸菌株的选育及其应用

  孙丹, 徐国霞, 王自强, 王云山, 张利平, 苏志国

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 83-88. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171111

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  为了解除微生物发酵生产丙酸过程中代谢产物（丙酸）对菌体生长的抑制作用，以实验室保藏的产酸丙酸杆菌（耐30g/L丙酸）为出发菌株P-0，通过丙酸压力筛选获得了一株耐10g/L丙酸的产酸性能良好的菌株P-10，降低了发酵过程中丙酸对菌体生长的抑制作用。菌株P-10做摇瓶发酵，发酵周期168h，丙酸浓度为49.66g/L，产酸速率为0.30g/（L·h），较出发菌株P-0提高了53.04%；7L发酵罐实验表明，菌株P-10发酵周期168h，丙酸浓度为55.63g/L，产酸速率0.33g/（L·h）。同时对菌株P-10做二次接种实验，结果表明，84h为二次接种最适时间段，且84h进行二次接种时，丙酸浓度提高了17.77%，二次接种实验不但有利于有机酸的积累，而且可以提高菌株的产酸能力和耐酸能力；经过选育的菌株P-10具有优良的产酸稳定性，有利于菌种的工业化生产和应用，同时对后续的发酵分离耦合具有重要意义。
技术与方法
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  非限制性内切核酸酶Sma的表达纯化工艺及性能研究

  徐一帆, 刘明秋

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 89-93. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171112

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  目的：大量表达非限制性内切核酸酶Sma并获得高纯度目的蛋白，对其酶活进行鉴定。方法：PCR获得Sma基因片段，构建pET28a-ompA-Sma表达载体，转入E.coli BL21（DE3）中，筛选出不同培养基下，目的蛋白可溶表达量最高的条件。通过渗透休克方法提取目的蛋白，并经离子交换纯化。检测不同的温度条件下Sma的酶活，并与商品化产品进行比较。结果：经PCR和测序证明重组蛋白表达质粒构建正确。可溶蛋白产量为7mg/L，每升培养基获得7 300kU的Sma，纯化后纯度>95%，活性达273U/μl（商品化产品为250U/μl）。结论：成功地表达了可溶性非限制性内切核酸酶Sma，纯度高、活性好，各项条件下活性皆不低于商品化产品。
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  应用CRISPR/Cas9技术构建miR-362敲除的95-D肺癌细胞株

  罗丹, 王莉娟, 孙秀璇, 张征, 陈志南

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 94-100. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171113

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  目的：运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，建立miR-362基因敲除的95-D肺癌细胞株，并研究miR-362在肿瘤中的调控作用。方法：针对人源miR-362基因序列设计gRNA，构建px330-gRNA载体；T7E1 assay确定gRNA的有效性。分别扩增miR-362上下游同源臂序列构建donor载体。利用脂质体将CRISPR系统和donor载体共转至人肺癌细胞系95-D，通过同源重组方法将筛选标志基因整合至基因组中，通过流式分选以及qPCR方法检测筛选出的细胞中miR-362表达水平。利用Transwell分析miR-362对细胞运动能力的影响。结果：与95-D细胞相比，95-D-KnockDown细胞中miR-362表达水平显著降低，且迁移侵袭能力分别下降了53.1%（P=0.000 6）和48.3%（P=0.000 2）。结论：利用CRISPR/Cas9系统成功构建了miR-362基因敲除的95-D细胞，miR-362可促进细胞的运动能力，为后续研究miR-362在肿瘤中的作用机制和功能奠定了基础。
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  胭脂萝卜花青素提取及对NCI-N87细胞增殖侵袭的影响

  梁姗, 蒋子川, 冯均

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 101-108. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171114

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  为研究胭脂萝卜花青素的提取工艺，考察了液料比、浸提温度、浸提时间、超声功率、超声时间对花青素提取率的影响。采用MTT实验、细胞侵袭实验研究了花青素对人胃癌细胞NCI-N87增殖、侵袭的作用，进一步用免疫印迹分析其对HER2信号通过的影响。结果表明，结合响应面分析得出胭脂萝卜花青素最佳提取工艺为：以1%盐酸乙醇为提取剂，液料比10：1，40℃浸提2h，400W超声波破碎15min，在此条件下，花青素的最高提取量为3.92mg/g。30μg/ml的胭脂萝卜花青素能显著抑制NCI-N87细胞的增殖和侵袭能力，同时抑制HER2蛋白及Akt的磷酸化水平。
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  莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体制备及应用

  刘雁霞, 樊振川

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 109-115. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171115

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  目的：亮氨酸拉链转录因子1（LZTFL1）是一种与纤毛信号转导相关的蛋白质，关于其如何在信号转导中发挥作用以及作用机制目前尚不清楚。莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是研究纤毛信号传导的模式生物，而目前对莱茵衣藻LZTFL1蛋白的研究甚少，尚未有相应的检测抗体，因此制备LZTFL1多克隆抗体用于后续实验研究。方法：采用RT-PCR技术从C.reinhardtii CC125中提取总RNA，扩增981bp的目的基因Lztfl1，插入到pET-28a（+）原核表达载体，成功构建pET-28a（+）-Lztfl1重组质粒，转入E.coli BL21（DE3）经IPTG诱导后成功表达6×His-LZTFL1融合蛋白，融合蛋白经亲和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，最后采用间接ELISA法测得抗血清效价达到1：512 000，经Western blot对C.reinhardtii CC125检测具有较高特异性。结果：首次实现了莱茵衣藻LZTFL1蛋白的原核表达，制备出一支兔抗莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体，为后续研究LZTFL1蛋白在莱茵衣藻中的结构功能及在纤毛信号转导中的相互作用奠定了基础。
综述
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  诱导多能干细胞技术在药物研发领域中的前景

  吴升星, 李艳, 张海燕, 刘洋, 赖琼, 杨明

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 116-122. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171116

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  由于基础研究环境和临床环境之间存在的转化差异，使得药物在临床阶段取得成功仍然具有挑战性。诱导多能干（iPS）细胞的诞生为药物研发领域带来了新的希望，使研究者能在体外人性化各种药理学和毒理学模型。人iPS衍生细胞的可获得性，特别是可以定向分化成特定的功能性细胞、组织和器官，一方面为疾病机制研究与细胞治疗提供了全新的途径。另一方面，转化研究中的生物标记物提供了评估临床前基础研究环境和临床环境下毒理学及药理学影响的可衡量的指标，而iPS细胞给生物标记物的研究带来了全新的思路。从转化研究的角度概述了基于iPS细胞药物发现的现行策略，阐明了iPS细胞的潜力以及生物标志物在药物发现和发展整个过程中的作用，突出在该领域有待改进的地方，以期为进一步相关性研究提供一定参考，为新药研发提供新的思路与方法。
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  优质L-天冬酰胺酶的开发与应用及重组表达研究进展

  曾杰

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 123-131. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171117

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  L-天冬酰胺酶用于治疗急性淋巴细胞白血病与淋巴瘤，但高昂的价格限制了临床上的广泛应用，重组表达解决了成本的难题。L-天冬酰胺酶所具有的低谷氨酰胺酶活性是其副作用的根源，同时细菌来源的L-天冬酰胺酶能导致危及生命的过敏反应，寻找副作用更低的优质L-天冬酰胺酶及其修饰方法，成为研究的重点。对L-天冬酰胺酶的重组表达，及具有更优性质的L-天冬酰胺酶开发进展进行了综述，并阐明其在临床治疗及食品工业领域的巨大应用潜力。
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  种泥预处理和发酵温度对暗发酵产氢的影响研究进展

  杨侠, 李茹莹

  中国生物工程杂志. 2017, 37(11): 132-140. https://doi.org/10.13523/j.cb.20171118

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  生物质暗发酵产氢不仅可以处理有机废物，同时可以获得清洁能源，实现了废物资源化利用。然而产氢种泥中大量耗氢菌的存在会导致暗发酵氢气产量低等问题，因此种泥预处理是暗发酵产氢的必需条件。随着暗发酵产氢基质的多样化，产氢种泥的预处理方法也不断发展。对近十年来产氢种泥预处理方法的发展进行了综述，并且结合发酵温度，讨论了种泥预处理方法和发酵温度两方面条件对暗发酵产氢的影响，并对该研究方向提出了展望，以期为后续暗发酵产氢的进一步研究提供参考。