目的：构建表达Cas9蛋白的亲骨转移人乳腺癌细胞株，并研究Cas9蛋白的表达对细胞生物学性质和超微结构的影响，为利用CRISPR/Cas9技术研究乳腺癌骨转移分子机制提供实验基础。方法：通过慢病毒载体介导Cas9蛋白基因转染亲骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO，通过G418筛选转染细胞，采用流式细胞术、Western blot、免疫细胞化学验证Cas9基因转染是否成功；运用实时无标记动态细胞分析技术和细胞划痕实验检测Cas9蛋白表达对细胞增殖及迁移的影响；透射电镜观察Cas9蛋白表达对细胞超微结构的影响。结果：成功构建稳定表达Cas9蛋白的亲骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO-Cas9，Cas9蛋白的表达对细胞的增殖、迁移和超微结构无明显影响。结论：MDA-MB-231BO-Cas9细胞可用于CRISPR/Cas9技术进一步研究。
干扰素α2b（interferonα2b,IFNα2b）是一种用于病毒性疾病和肿瘤性疾病治疗的多功能细胞因子，因其在体内的半衰期短限制了其在临床上的应用。将IFNα2b连接到人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）的C端，构建融合蛋白HSA-IFNα2b。构建含融合蛋白的真核表达质粒pMH3/HSA-IFNa2b，经电转的方法转入中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞中。经G418抗性压力筛选和目的蛋白的表达量筛选，最终获得一株高表达的稳定细胞株（CHO/pMH3/HSA-IFNa2b）。表达的目的蛋白经Western blot验证显示，产物具有IFNα2b和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后，通过批次筛选得到一株稳定的高克隆表达株，产量约为65mg/L，进一步选取高表达克隆株在悬浮驯化中不同代数进行批次培养，不同代数之间蛋白质的表达量和生长情况没有明显的差异，获得一株稳定遗传表达的单克隆细胞株，3L摇瓶的流加培养结果显示，最佳发酵时间为15天，蛋白质表达量为121mg/L。经离心获得的发酵液，经两步纯化后获得蛋白质纯度高达96.8%的目的蛋白，总回收率为22.3%。参照《中国药典》2015版对IFNα2b的检测方法，结果显示，CHO表达的HSA-IFNα2b比活性为4.16×106IU/mg。首次将HSA-IFNα2b在哺乳动物细胞CHO中构建表达，表达获得高活性的HSA-IFNα2b融合蛋白。
目的：研究前蛋白转化酶枯草溶菌素6（proprotein convertase subtilisin/kextin type 6,PCSK6）对可溶性corin的活化作用，以及PCSK6作用后的可溶性corin是否具有生物学活性。方法：以野生型corin质粒为模板，通过PCR扩增出不含跨膜区的corin基因片段，并将目的基因克隆至真核表达载体pSEC得到重组质粒pSECsolCorin，测序验证。分别将可溶性corin、PCSK6及心钠肽前体（pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP）的表达载体转染人胚胎肾（human embryonic kidney,HEK）293细胞，收取上清液。然后将可溶性corin上清液与不同体积的PCSK6上清液共同孵育，免疫印迹（Western blot）方法检测corin蛋白的活化情况。再将PCSK6作用后的可溶性corin与pro-ANP上清液共孵育，检测可溶性corin的生物学活性。结果：构建了可溶性corin的表达质粒，并在HEK293细胞成功表达可溶性corin蛋白。可溶性corin的上清液与pcsk6上清液共同孵育后可检测到活化条带，并可使pro-ANP活化为ANP。结论：PCSK6同样可以剪切活化可溶性corin蛋白，活化后的corin具有生物学活性。为可溶性corin用于心衰的临床治疗提供了重要基础。
基于抗原-抗体特异性反应的免疫学方法是黄曲霉毒素B1的常用检测方法。为制备针对AFB1的抗体，综合参考已报道的噬菌体文库筛选的抗AFB1单域重链抗体（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH）序列，合成一条经密码子优化[适于大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）表达]的高同源性序列。在抗AFB1 VHH的CDR2和CDR3区引入部分随机突变，构建噬菌体抗体库。采用phage-ELISA技术，以AFB1O-OVA为包被抗原，淘选单域重链抗体库，经过4轮筛选，获得15株能与AFB1特异性结合的阳性克隆。以结合力最高的1株克隆为材料，扩增相应的VHH基因，构建表达质粒pET-22b-VHH。在E. coli BL21（DE3）中表达VHH，经间接竞争ELISA分析，获得的抗AFB1 VHH的灵敏度约为10μg/mL。
14-3-3蛋白家族是由多个高度保守的成员构成的调节性蛋白质家族，它们主要以磷酸化的形式与伴侣蛋白相互作用，并能够以多种方式来影响靶蛋白。通过构建14-3-3蛋白原核表达载体，纯化重组蛋白获得14-3-3蛋白抗体。为了验证14-3-3蛋白基因在耐铝中的作用，构建14-3-3酵母表达载体，得到14-3-3过表达酵母菌株。在5mmol/L铝浓度下，转基因酵母比对照酵母长势好，这表明14-3-3蛋白通过促进生长赋予酵母对铝胁迫的耐受性。
利用肠道病毒71型（EV71）衣壳蛋白优势表位肽段构建融合蛋白抗原能有效抑制病毒感染，有望成为继灭活病毒后更为安全有效的疫苗品种。该融合蛋白能通过原核体系有效表达但形成无序包涵体，采用常规层析介质难以实现目标蛋白与宿主杂质的有效分离，阻碍了对该抗原蛋白进行全面临床前活性及安全性评价。在原有融合蛋白抗原N端插入组氨酸标签，对形成的包涵体变性溶解后直接采用镍金属螯合亲和介质进行分离纯化，获得了纯度大于95%的抗原纯品，目标蛋白收率46.8%。采用透析方式脱除纯化样品中高浓度脲，发现直接透析至无脲的缓冲液中蛋白质大量沉淀，而先稀释至2mol/L脲的缓冲液中然后用G25脱盐柱完全脱除脲则无任何沉淀形成，获得近100%的蛋白质收率。透射电镜分析最终样品发现融合蛋白形成了10nm左右粒径均一的类病毒蛋白颗粒，且在pH 8.0的磷酸盐缓冲液中保持稳定。该研究结果为将EV71融合蛋白抗原发展为安全有效且低成本的手足口疫苗奠定了基础。
拟利用CRISPR/Cas9技术建立编辑FGF5基因的绒山羊细胞株。在FGF5基因的第一外显子设计靶点并合成gRNA靶点引物，构建2个编辑FGF5基因的Cas/gRNA真核表达质粒载体。电穿孔法转染绒山羊成纤维细胞后T7核酸内切酶（T7E1）检测载体活性，选择活性最高的载体转染细胞，单细胞接种并扩繁，提取基因组DNA，PCR及测序鉴定。经测序分析共获得20个FGF5基因敲除细胞株（包括FGF5+/-和FGF5-/-），总突变率为14.81%。双敲除突变细胞株可作为供体细胞进行重构胚构建，为创造高产绒性状的FGF5基因编辑绒山羊奠定基础。
Bst DNA聚合酶大片段作为一种常用的DNA聚合酶，因其独特的特点：能引发链置换反应、高保真、耐高温等，而成为一种重要的DNA多重置换扩增酶。目的：为减少成本，设计一种高产，方便且扩增活性高的Bst DNA聚合酶大片段表达体系；探究该酶应用于胃癌石蜡包埋组织基因组DNA的扩增条件。方法：采用pTWIN1质粒作为载体克隆表达Bst DNA聚合酶大片段，应用几丁质亲和层析柱纯化该酶，使用该酶对人类基因组DNA进行不同温度下扩增，探究其最适反应温度，并据此对胃癌石蜡包埋组织基因组DNA进行扩增。结果：由此得到的Bst DNA聚合酶大片段能运用于胃癌石蜡包埋组织基因组DNA的扩增，扩增效率可达200倍，并能应用于aCGH芯片。结论：扩增得到保真性高，覆盖基因组范围大的DNA扩增产物。该应用与aCGH结合，使得对少量的癌症石蜡包埋组织DNA样本进行全基因组扩增，并进行其基因拷贝数变异研究成为可能。
目的：筛选一株具有广谱抗菌活性的炭样小单孢菌JXNU-1中核苷类抗生素生物合成相关蛋白。方法：通过iTRAQ定量蛋白质组学技术对JXNU-1菌体生长期（36h）和产物合成期（108h）的差异蛋白进行鉴定和功能分析。结果：基于iTRAQ定量蛋白质组学技术共鉴定出炭样小单孢菌总蛋白质2390个，差异表达蛋白172个，在产物合成期（108h）表达上调76个、表达下调96个。通过蛋白GO和COG注释等功能分析，筛选出12个与抗生素合成密切相关蛋白和5个生物合成基因簇。结论：利用iTRAQ技术筛选出炭样小单孢菌JXNU-1的抗生素合成相关蛋白，为阐明该抗生素的生物合成机制奠定实验依据。
弱氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacter suboxydans）可高效不完全氧化多种糖类和醇类等多羟基化合物，生成相应的醛类、酮类和有机酸类等产物，是一类重要的工业微生物。利用同源重组技术对基因组进行修饰改造是工业育种的有效手段。传统方法多选用抗生素为筛选标记，存在诸多缺陷。构建尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因缺失菌株以实现Gluconobacter suboxydans基因组无痕修饰为目标，将自杀质粒pMD18-Jqupp电转化至野生型Gluconobacter suboxydans J12中，通过四环素抗性和5-氟尿嘧啶双重筛选，获得敲除了编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶的基因upp的突变株。经生理验证表明，该突变株在含0.5mg/ml 5-氟尿嘧啶的培养基上生长，而回补upp基因后，在0.5mg/ml 5-F氟尿嘧啶的培养基上不生长。说明获得的G.suboxydans-upp突变株能以upp基因作为负向筛选标记，通过两次同源重组，实现Gluconobacter suboxydans基因组无痕修饰与改造，为今后代谢工程改造Gluconobacter suboxydans获得有价值的工业菌种奠定基础。
土霉素是由龟裂链霉菌合成的一类广谱性抗生素，前期研究工作证明其生物合成受其自身途径特异性调控蛋白OtcR的直接调节，OtcR能够激活和促进土霉素合成基因簇的转录表达。在龟裂链霉菌M4018宿主内利用强启动子单独过表达OtcR蛋白，使土霉素的产量提高到原来产量的4倍；为了进一步提高土霉素产量，在M4108宿主内表达乙酰辅酶A羧化酶基因，提高其胞内土霉素合成的前体物丙二酸单酰辅酶A的含量。对出发菌株M4018进行工程改造，同时过表达途径特异性调控蛋白OtcR和乙酰辅酶A羧化酶，发酵检测改造后的重组工程菌株土霉素的产量由1.37g/L提高到9.09g/L，该研究策略对工程改造龟裂链霉菌提高土霉素的产量具有重要的指导意义。
酿酒酵母是一种重要的食品安全的工业微生物宿主。如何精确地控制代谢路径中相关基因的表达强度，是在酿酒酵母体内合成β-胡萝卜素的关键因素。通过在Delta位点整合红发夫酵母来源的β-胡萝卜素合成基因（crtE、crtI、crtYB），构建β-胡萝卜素生产菌库。从中挑选28株颜色较黄的菌株，通过96孔细胞培养板及摇瓶发酵，发现这些菌株β-胡萝卜素产量存在显著差异（产量从5.70mg/L到61.88mg/L动态分布）。然后以其中β-胡萝卜素产量最高的菌为出发菌（SyBE_Sc118012），在敲除该菌株内源基因ypl062w的同时，在此位点过表达tHMG1和BTS1-ERG20融合蛋白以增加前体供应，最终使β-胡萝卜素的产量提高1.65倍，达到162.1mg/L，是目前已知的摇瓶水平最高发酵产量。因此，通过Delta位点整合和增加前体供应结合的策略来强化酿酒酵母中的异源表达具有重要的指导意义。
广泛存在于细菌和古细菌中的CRISPR/Cas系统是通过介导外源DNA降解来实现抵抗病毒和外源DNA入侵的一种适应性免疫保护机制，也是新近发展起来的基因组定点编辑技术。从基本结构、作用机制、分类、运用等方面详细地介绍了CRISPR/Cas系统，并分析了该技术在畜禽遗传改良中的运用前景。
治疗性抗体药物针对不同的适应证具有专一性和有效性。目前已上市的治疗性抗体药物多是以IgG为框架开发的，并且绝大部分属于IgG1亚型。在治疗性抗体药物的开发中，由于各亚型具有不同的结构与功能，影响其理化性质、生物活性和触发效应功能的能力等，为达到期望的治疗效果并且避免不良反应，应选择适宜的抗体亚型进行抗体设计。主要综述了影响IgG亚型选择的相关因素，以及IgG1、IgG2和IgG4亚型在治疗性抗体药物开发中的应用研究，以期为治疗性抗体药物研发提供新思路。
高山被孢霉是一种重要的产油丝状真菌，其油脂积累量高达细胞干重的50%，其中具有重要生理活性的多不饱和脂肪酸含量较高且种类丰富。近年来，针对高山被孢霉遗传操作系统建立的分子生物学研究进展迅速，这为进一步提高其多不饱和脂肪酸合成水平奠定了基础。对高山被孢霉遗传操作系统的最新应用进展进行了综述，包括高山被孢霉的转化方法、筛选标记的种类、各种方法的优缺点及遗传操作系统的应用。
目的：从产品开发角度分析全球合成生物学发展现状和趋势。方法：在伍德罗·威尔逊国际学者中心的合成生物学产品和应用清单（synthetic biology products and applications inventory）的数据基础上，对全球合成生物学产品的开发状态、市场应用和发展前景等进行补充检索和分析。结果：至2015年，全球至少已有81家企业（或研究机构）的116种合成生物学产品得到了市场应用开发，主要开发者为美国企业（或研究机构），产品主要集中于化学和医药领域。结论：合成生物学实现了从生物学分析向生物学合成的范式转移，其产品开发将给一系列的行业带来深刻的变革。
细胞药物制备的质量直接关系到细胞治疗的效果。由于细胞治疗所用细胞是具有生物学效应的，细胞药物的制备技术和应用方案具有多样性、复杂性和特殊性，不像一般生物药物那样有统一的制作标准。细胞药物的制备过程主要包括供者筛查、供者检测、采集、加工、分离纯化、储存等，以造血干细胞、间充质干细胞、肝细胞及树突状细胞为例对其进行简要介绍。
