中国生物工程杂志

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2013年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势

Clive James

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 1-8. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140101

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重组狂犬病病毒糖蛋白活酵母疫苗经小鼠口服给药后的免疫效果

赵慧, 郑文岭, 彭翼飞, 马文丽

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 9-14. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140102

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目的：研究以活酵母为输送载体的狂犬病疫苗对小鼠的免疫保护能力和免疫疗程。方法：小鼠首先灌食高浓度空白活酵母INVSI，并于灌胃后8h和12h分别采集小鼠空肠和回肠组织并提取小肠浸出液培养，计算活酵母经肠胃环境后的存活率；分别取狂犬病糖蛋白（glycoprotein，G）分泌型表达菌株pYes-InG和胞内表达型菌株pYes-G灌胃小鼠，灌胃结束后12h采集小鼠血清和小肠组织，采用免疫组织化学方法检测抗原物质G在小肠上皮细胞的分布，采用ELISA检测小鼠血清中和性抗体的滴度。结果：活酵母经灌食消化8h后在小肠中的存活率最高达36.11%，12h后降至0.59%；口服分泌型pYes-InG重组酵母的小鼠小肠组织和血清中能检测到抗原物质G和低量的中和性抗体，ELISA分析显示，小鼠经过3～4次免疫接种，免疫效果基本恒定，而口服胞内表达型pYes-G重组酵母的小鼠小肠组织和血清中均未检测到目标物。结论：分泌型重组酵母pYes-InG经多次口服可对狂犬病起到一定的预防作用，但它诱导产生的中和性抗体浓度低，免疫应答慢，虽不适合用于控制突发性狂犬病的传染以及治疗狂犬病患者，但从免疫机制、免疫方式、安全性以及生产成本等因素考虑，仍具有良好的研究价值。

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癌症靶向基因-病毒ZD55-XAF1抗肝癌移植瘤的生长及其安全性研究

马步云, 何婉婉, 周立, 王毅刚

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 15-20. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140103

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目的：探讨溶瘤腺病毒（ZD55-gene）作为载体携带外源抗癌基因（XAF1）抗肝癌移植瘤的生长及其安全性。方法：抽提溶瘤腺病毒ZD55-XAF1的基因组DNA，PCR扩增鉴定病毒；细菌平板培养和支原体检测试剂盒检测细胞有无细菌、支原体污染；通过荷瘤小鼠动物实验，观察溶瘤腺病毒ZD55-XAF1对肝癌移植瘤生长的抑制、小鼠的临床反应指标、血清肝毒性指标、各脏器组织中的病毒残留分布及病理切片观察。结果：细胞培养过程无细菌和支原体污染；较对照组，受试小鼠血清肝酶AST活性上升（P<0.05），而ALT和ALP活性基本无变化（P>0.05）；PCR检测各脏器均有病毒基因组DNA存在；HE染色显示受试小鼠各脏器具有不同程度的损伤，病毒处理对肿瘤细胞具有明显的杀伤效果，而受试小鼠的临床反应并无明显异常。结论：溶瘤腺病毒ZD55-XAF1能够抑制肿瘤生长，杀死肿瘤细胞，对小鼠血清肝酶活性影响较小而对各脏器有不同程度的轻微损伤，作为癌症基因治疗载体有潜在的应用价值但其安全性还有待提高。

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枸杞紫黄质脱环氧化酶（LcVDE）基因的克隆和分析

张旭强, 季静, 王罡, 钟影, 刁进进, 关春峰, 吴疆, 金超

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 21-27. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140104

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目的：克隆枸杞VDE基因的全长cDNA，通过对基因序列的生物信息学分析预测表达产物的结构特征和功能位点并验证其功能，为研究枸杞紫黄质循环的作用机理打下基础。方法：利用cDNA末端快速扩增和RT-PCR方法克隆枸杞VDE基因全长cDNA序列，生物软件分析VDE的生物学信息。构建VDE基因的原核表达载体pET-VDE，转化大肠后用IPTG诱导VDE过量表达；并构建体外反应体系对VDE表达蛋白酶功能进行验证。结果：LcVDE基因的ORF长1 413bp，编码的蛋白由470个氨基酸组成，分子量为53.61kDa，等电点为5.77。SDS-PAGE电泳结果表明，枸杞VDE基因在大肠杆菌中得到了过量表达。克隆基因表达蛋白进行紫黄质的脱环氧化反应，吸收光谱和HPLC的分析结果表明，表达蛋白催化了紫黄质的脱环氧化反应。结论：克隆得到的VDE基因编码的蛋白具有紫黄质脱环氧化酶的的功能与活性。

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本氏烟Ⅰ型启动子的克隆及其转录起始位点分析

李志英, 牟红珍, 高丁梅, 丁国平, 马婷, 王盛

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 28-35. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140105

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启动子是转录水平上一个重要的调控元件，其决定着基因的表达模式和表达强度。Ⅰ型启动子具有高转录活性和种属间特异性等特点。如将其应用于植物RNA病毒载体表达系统，有利于提高表达系统的表达效率和生物安全性。本氏烟（Nicotiana benthaminana）是一种被广泛地应用于植物生物反应器和植物病理学的模式生物，但是现有核酸数据库中尚没有其Ⅰ型启动子的相关信息。因此，克隆本氏烟Ⅰ型启动子并分析其转录起始位点就具有重要的应用价值。通过半巢式PCR获得了514 bp的本氏烟Ⅰ型启动子序列（KC352713）；生物信息学分析初步预测其转录起始位点位于其核心序列TATA（G）TA（N）GGGGG中的第3位A处；通过植物RNA病毒表达载体和5’RACE技术在体内验证本氏烟Ⅰ型启动子转录起始位点与生物信息学预测结果一致。研究结果为深入研究Ⅰ型启动子和构建Ⅰ型启动子介导转录的植物RNA病毒载体表达系统奠定了基础。

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利用原核表达系统一步法制备生物素标记蛋白质

谢小丽, 程剑松, 王晓敏, 梅香寒, 刘琳, 李静

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 36-41. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140106

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传统的蛋白质生物素标记多采用体外化学修饰法，涉及生物素和蛋白质的活化、透析和纯化等多种处理，该方法步骤繁琐，且对目的蛋白的损失较大。本实验利用原核共表达质粒pCDFDuet-1，将含有6个组氨酸标签的人己糖苷酶D（hexosaminidase D，HexD）的cDNA与生物素受体多肽（biotin acceptor peptide，BAP）DNA进行PCR拼接，连入pCDFDuet-1的多克隆位点1（multiple cloning site1，MCS1）；将以大肠杆菌Trans5α基因组为模板克隆得到的生物素连接酶（biotin ligase，BirA）基因连入 MCS2 ，构建重组质粒pCDFDuet-hexD-BAP-birA。初步验证后将该质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中，利用0.1 mmol/L的IPTG和80 μmol/L的生物素进行诱导表达，采用Ni-NTA亲和层析和超滤对HexD进行纯化，SDS-PAGE检测分子量的大小（60 kDa）和纯度（90%以上）。以anti-HexD和链霉亲和素-HRP为抗体，Western blot检测发现，HexD-BAP表达正确，且被生物素标记；同时以4-MU-O-GalNAc为荧光底物，检测到生物素化标记HexD的糖苷酶活性为3.6 nmol/（min·μg），与未标记HexD的活性（3.06 nmol/（min·μg））相当。结果表明，可以利用BirA及其受体多肽，通过共表达质粒pCDFDuet-1，一步转化、表达和纯化，在大肠杆菌中进行外源蛋白的表达和生物素标记，且不改变目的蛋白的生物活性，可应用于免疫标记、互作蛋白的捕获等生物学研究。

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莱克多巴胺核酸适配体电化学生物传感器的研制

周妮, 陈丹, 姚冬生, 谢春芳, 刘大岭

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 42-49. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140107

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莱克多巴胺（RAC）被大量非法用于畜牧生产，易在动物组织残留，对人体造成危害。因此，研发灵敏、快捷的检测RAC的新方法是有效控制RAC滥用的关键环节之一。通过等温滴定量热法筛选到了一条对莱克多巴胺有高亲和力（K_d=1.66×10^-6 mol/L）的核酸适配体，利用该适配体作为识别分子成功的构建了莱克多巴胺适配体电化学生物传感器。差分脉冲伏安法分析，在0.5~1.0×10²ng/ml浓度范围内，峰电流值的差值ΔIp与莱克多巴胺浓度的对数呈现良好的线性关系，相关系数R² = 0.977 0，检测限达到0.1 ng/ml，反应时间为15 min。对同一浓度的莱克多巴胺重复检测7次，其峰电流值的RSD值为3.8%；说明该传感电极具有良好的检测重现性。不仅如此，该适配体传感器还具有良好的选择性。

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柠条锦鸡儿肉桂酰辅酶A还原酶基因克隆和分析

李高, 杨杞, 张烨, 王颖, 张涛, 李国婧, 王瑞刚

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 50-56. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140108

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肉桂酰辅酶A还原酶（cinnamoyl-CoA reductase，CCR）是木质素特异合成途径中的关键酶。根据已报道的植物CCR基因序列设计简并引物，利用RACE技术，首次从柠条锦鸡儿（Caragana korshinkii Kom.）中克隆得到CCR基因全长cDNA序列，命名为CkCCR，GenBank 登录号为HQ829859。该序列长1 270bp，具备长度为1 014bp的完整开放阅读框（ORF）。推导该基因编码的蛋白质有434个氨基酸，预测等电点6.69，分子量36.76kDa。序列分析发现，柠条锦鸡儿CCR基因推导的氨基酸序列与其它植物来源的CCR序列高度相似，并且具有植物CCR共有的氨基酸序列“KNWYCYGKA”以及NADPH的结合序列。系统进化分析显示，柠条锦鸡儿CCR与拟南芥CCR2处于同一分支，与同属豆科的银合欢CCR亲缘关系最近。利用荧光定量PCR技术对柠条锦鸡儿一个月龄幼苗基因转录水平进行检测，结果显示CkCCR基因在根、茎、叶中广泛表达，并且干旱处理初期表达量有所下降，处理后期又恢复到未处理时的表达水平。

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表达HIV-1 gag重组鸡痘病毒的构建与筛选

朱羿龙, 李昌, 郭焱, 刘存霞, 杜寿文, 王茂鹏, 金宁一

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 57-63. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140109

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构建并筛选表达HIV-1 gag蛋白的重组鸡痘病毒，并对其进行鉴定。首先设计引物通过PCR技术扩增HIV-1 gag基因，将其连接到pMD18-T载体上，测序正确后将其克隆入本实验室自行构建的鸡痘病毒穿梭载体pTKET中，获得重组质粒pTKET-HIV gag。然后将其与鸡痘病毒FPV282E4株共转染原代鸡胚成纤维细胞（CEF）进行同源重组，以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为筛选标记，通过噬斑筛选获得重组病毒，应用PCR，RT-PCR，Western blot方法对重组病毒进行鉴定和遗传稳定性分析。结果：通过10次噬斑筛选，PCR检测表明目的基因已整合到重组鸡痘病毒基因组中，RT-PCR，Western blot结果表明HIV-1 gag在感染细胞内成功表达且具有抗原性。连续传代20次，PCR，RT-PCR，Western blot均能检测到外源基因的整合、转录和表达，且未能扩增出FPV-TK基因，表明重组病毒遗传稳定性良好，而且病毒已经纯化。结论：成功获得表达HIV-1 gag的重组鸡痘病毒，为进一步免疫试验研究奠定基础。

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犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒的构建及免疫效果评估

袁颖烁, 宋菲菲, 刘国强, 刘晔, 张守峰, 张乐萃, 扈荣良

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 64-70. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140110

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研究选取犬瘟热病毒H蛋白基因为目的基因，利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、酶切、连接等方法构建出重组人5型腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，两者共转染293AD细胞并包装出重组腺病毒。通过电镜负染、酶切鉴定、Western blot及一步生长曲线测定等方法进行病毒的生物学特性鉴定，证明犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒构建正确。犬分别肌肉接种CDV疫苗毒和重组腺病毒，并检测免疫后第14，28，42，56，70，84d时犬血清中抗CDV中和抗体的变化情况。结果显示，犬免疫重组腺病毒后体内产生的抗CDV平均中和抗体水平高于对照组，滴度最高达2^-8。研究表明，正确构建的重组腺病毒具有良好的免疫原性，诱导产生的抗犬瘟热病毒中和抗体达到犬最低免疫保护水平，为进一步研发犬瘟热病毒活载体疫苗提供理论依据。

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基于核糖体工程理论的常压室温等离子体诱变筛选多杀菌素高产菌

乔长晟, 赵男, 石漫漫, 朱明, 李雪

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 71-78. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140111

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利用核糖体工程理论，采用常压室温等离子体（ARTP）诱变对刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）进行诱变筛选。以刺糖多孢菌QYLZ 88912菌株为出发菌株，对其进行ARTP诱变，选取三个不同致死率的照射时间，将孢子悬液混合，以增加抗性筛选几率。然后基于核糖体工程技术理论对混合孢子悬液进行初筛，最终筛选出了1株多杀菌素高产菌Sg²⁰⁰Rif¹¹⁰St⁴⁰Er⁹⁰-028。该菌株同时具有磺胺胍、利福平、链霉素、红霉素的多重抗性，摇瓶发酵试验表明，发酵7d后多杀菌素浓度可达到1 516.93 mg/L，较出发菌株QYLZ 88912的产量610.75 mg/L提高了148.37%，且遗传性稳定。以得到的高产菌Sg²⁰⁰Rif¹¹⁰St⁴⁰Er⁹⁰-028作为出发菌株，对发酵培养基进行响应面优化实验，优化后的培养基（g/L）：葡萄糖46.97、麦芽糊精35、酵母粉40.36、水浸棉籽粉32.88、碳酸钙3，多杀菌素的产量为2 361.81 mg/L，比出发菌株的产量提高了286.71%。

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人源溶菌酶基因LYZL4在毕赤酵母中的重组表达及活性测定

李新新, 陶建军, 余龙

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 79-85. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140112

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LYZL4是本实验室克隆的一种c型人溶菌酶基因，根据毕赤酵母密码子偏爱性对LYZL4基因进行优化设计，优化后的基因克隆至具有乙醇氧化酶启动子（AOX1）的pPIC9K载体中。通过电转化方法整合到甲醇营养型毕赤酵母表达菌株GS115基因组上，再利用不同浓度梯度的G418抗性YPD固体培养基筛选高拷贝转化子，经摇瓶发酵后，其上清液在SDS-PAGE胶上14.4 kDa处出现明显的蛋白条带，该蛋白条带经质谱鉴定证实是人LYZL4蛋白。以人溶菌酶（164 071U/mg）作为标准品，使用艳红微球菌作为底物，通过比色法测定重组LYZL4溶菌酶蛋白的活性，结果显示重组人溶菌酶LYZL4蛋白具有明显的溶菌活性，其酶活力可达38893U/ml。

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从富集液中发掘麻类脱胶果胶酶基因的技术

段盛文, 刘正初, 郑科, 冯湘沅, 成莉凤, 郑霞

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 86-89. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140113

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为了突破传统可培养技术筛选麻类脱胶用果胶酶基因的不足，通过设计不同总DNA提取方法、样品富集方法以及优化PCR 反应体系，建立起了一套适合于直接从富集液中发掘麻类脱胶用果胶酶基因的技术。结果表明，震荡培养脱胶时间比静止培养脱胶时间缩短51.5%；通过PowerSoil^TM DNA Isolation Kit从第4次富集后的震荡发酵中能提取适合的总DNA；PCR最优反应体系为：总体积为25 ml，Mg²⁺浓度为2.0 mmol/L，dNTPs浓度为0.2 ng/μl，引物浓度为0.6 μmol/L，DNA模板取2.5 ng/μl，Taq聚合酶量为0.8 U。获得的基因序列与已报道的果胶酶基因FJ538208序列高度相似，应用该技术成功地从麻类脱胶富集液中克隆到了果胶酶基因。

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大孔吸附树脂分离纯化培养基残基中虫草素

李从镇, 毛宁

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 90-94. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140114

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采用大孔吸附树脂分离纯化人工蛹虫草培养基残基中的虫草素，以HPLC法测定样品中虫草素含量，筛选出了适宜的大孔树脂NKA-Ⅱ。研究了pH、洗脱剂乙醇体积分数等因素对该树脂吸附性能及解析性能的影响。结果表明，NKA-Ⅱ型树脂纯化虫草素的最佳吸附条件为pH9，吸附流速2BV/h，该树脂对虫草素的吸附量可达到16.5mg/g。洗脱工艺条件为2.5倍树脂柱体积的50%乙醇，NKA-Ⅱ大孔树脂对虫草素的解析率可达到95%以上。

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哺乳动物细胞表达系统研究进展

李国坤, 高向东, 徐晨

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 95-100. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140115

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目前，哺乳动物细胞已成为生产多种生物药物的首选宿主细胞。哺乳动物细胞表达系统可进行翻译后修饰，表达的重组蛋白接近人源构象，因此被大量用于治疗性重组蛋白的生产，如何建立高效的哺乳动物细胞表达系统也受到研究者们的重视。随着基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学研究不断深入，近几年来在优化哺乳动物表达系统方面取得了长足的进步。从高效表达载体构建、宿主细胞改造、高通量筛选、培养基优化等方面阐述哺乳动物细胞表达系统的研究进展，以期为研究者们提供一定的帮助。

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在医疗保健领域开发和使用生物标记物的政策性问题

Rachael Ritchie, Marie-Ange Baucher

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 101-126. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140116

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描述了发展中的生物标记物所处的科学、产业、监管和医疗保健管理系统背景，指出了可能阻碍生物标记物研究、发现、发展、商业化及最终临床应用的一些障碍，聚焦了医疗保健中基于生物标记物的诊断方法和医学检验的应用，探索了生物标记物在改良药物开发中的应用。

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关于我国药典单克隆抗体类生物治疗药物总论的思考

高凯, 徐志凯, 任跃明, 王兰, 王军志, 郭中平

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 127-134. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140117

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单克隆抗体类生物治疗药物目前是国内外生物药中增长最快的领域。药品的规范生产与质量控制与其安全有效性息息相关，欧美药典中均设有对此类药品质量控制的总体要求，2015版《中国药典》在进一步保障药品安全和提高质量控制水平的编制指导思想下，也拟纳入对单克隆抗体类生物治疗药物的总体要求，就相关起草工作从产品涉及范畴、制造与产品检定等方面进行阐述。

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我国疫苗的研究与开发

王莹

中国生物工程杂志. 2014, 34(1): 135-137. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140118

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2014年, 第34卷, 第1期　
刊出日期：2014-01-25

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