2013年, 第33卷, 第2期　
刊出日期：2013-02-25

  

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专稿
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  2012年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势

  Clive James

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 1-8.

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研究报告
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  牛乳铁蛋白肽转基因小鼠的构建

  张锦霞, 范志强, 刘晔, 张守峰, 杨洋, 王颖, 张菲, 扈荣良

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 9-13.

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  目的:探讨牛乳铁蛋白肽在转基因鼠乳汁中的表达及其抑菌活性。方法:将实验室构建并保存的包含山羊β-酪蛋白基因启动子和牛乳铁蛋白肽基因的乳腺特异表达载体PI-bcp-LfcinB,用Xho I和Nru I双酶切,得到含有全部表达盒的显微注射DNA片段,采用常规显微注射技术获得转基因小鼠。并通过对泌乳期转基因雌鼠乳腺组织的RT-PCR检测,确定了牛乳铁蛋白肽在mRNA水平的表达,同时利用琼脂板扩散法检测了转基因鼠乳汁中表达产物的抑菌活性。结果:获得了牛乳铁蛋白肽转基因小鼠,且转基因小鼠乳汁中能够表达具有抑菌活性的牛乳铁蛋白肽。结论:通过转基因动物乳腺可以获得具有生物活性的牛乳铁蛋白肽,为进一步研究抗菌肽转基因牛、培育抗乳房炎奶牛新品种以及通过建立转基因动物生物反应器进行抗菌肽的大量生产奠定了基础。
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  轮状病毒灭活疫苗和减毒活疫苗序贯免疫的体液免疫应答效果

  张标, 佟琳, 易山, 张光明, 李鸿钧, 孙茂盛, 陈东

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 14-20.

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  目的:评价采用轮状病毒灭活疫苗进行初始免疫,减毒活疫苗进行加强免疫的序贯免疫方案的体液免疫应答效果。方法:将实验小鼠随机分为4组(口服疫苗组、序贯疫苗组、口服对照组及序贯对照组),按相应方案免疫后,ELISA检测血清轮状病毒特异性IgG和IgA、肠道轮状病毒特异性IgA;微量中和实验检测血清病毒特异性中和抗体;同时采用ELISA分析口服活疫苗后病毒排出情况。结果:与对照组相比,序贯疫苗组小鼠产生的轮状病毒特异性血清IgG、IgA、中和抗体及肠道IgA水平显著升高。与口服疫苗组相比,序贯疫苗组的免疫方案诱发的轮状病毒特异性血清IgG、IgA、中和抗体水平显著升高,肠道IgA水平两组间没有显著差异。同时,与口服疫苗组相比,序贯疫苗组中轮状病毒灭活疫苗进行的初始免疫未影响第一次口服活疫苗后病毒的排出量和排出时间,但序贯疫苗组第二次口服活疫苗后病毒的排出量迅速减少,排毒时间快速缩短,与口服疫苗组第三次服苗后病毒的排出量和排出时间相似。结论: 轮状病毒灭活疫苗和减毒活疫苗序贯免疫可有效诱发小鼠全身和黏膜局部的体液免疫应答,该方案将有可能成为轮状病毒疫苗临床应用的候选方案。
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  RUNX2对BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响

  赵艳芳, 宋涛, 刘跃亮, 罗进勇

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 21-26.

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  目的:研究和确认RUNX2在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:通过Western blot、RT-PCR、荧光素酶活性分析检测BMP9对RUNX2表达的影响;分别在过表达RUNX2和RNA干扰抑制RUNX2表达的情况下,利用碱性磷酸酶(ALP)活性测定和染色、钙盐沉积实验,免疫细胞化学和裸鼠皮下异位成骨实验分析RUNX2对于BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的影响。结果:BMP9可以促进RUNX2的表达;RUNX2体外可促进BMP9诱导的C3H10T1/2的ALP活性和钙盐沉积,却抑制了OCN表达,RUNX2还可促进BMP9诱导的裸鼠皮下异位成骨;而在降低RUNX2表达后,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积、OCN表达和裸鼠皮下异位成骨均受到抑制。结论:RUNX2可以促进BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化。
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  强磁场重力环境对Pseudomonas aeruginosa N1207的影响

  赵健烽, 辛兴, 卫培培, 骞爱荣, Akateh Tazifua Alfred, 商澎, 杨树林

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 27-33.

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  旨在研究由超导磁体产生的强磁场重力环境(HMGE)对Pseudomonas aeruginosa N1207的影响。该磁体是经特殊设计的大梯度超导磁体,可产生多个重力梯度(从失重到超重)以及相应的磁场强度,分别为(0 g,12 T)、(1 g,16 T)和(2 g,12 T)。Pseudomonas aeruginosa N1207在HMGE中分别诱变24h、48h和72h之后,从磁场强度最高(16 T)组别中筛选得到最佳的突变株M14808。结果表明M14808的鼠李糖脂产量提高了30%以上并且遗传特性稳定。比较生长周期发现,突变株到达指数生长期早于原始菌株。诱变实验结果表明强磁场是引起诱变的主要因素从而导致鼠李糖脂产量变化和生长周期改变。抗肿瘤实验结果显示双鼠李糖脂可抑制四株肿瘤细胞,分别为MCF-7、H460、HepG2和A549,双鼠李糖脂对MCF-7的效果最佳,其IC₅₀为125.13μg/ml。
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  温度胁迫对白桦悬浮细胞中三萜积累及防御酶活性的影响

  赵微, 尹静, 詹亚光, 任春林, 王艳, 马泓思, 苏欣

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 34-40.

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  以白桦悬浮培养细胞为试材,悬浮培养第7d进行高温(50℃热处理1h)和低温(4℃冷胁迫3h)胁迫处理,此后不同时间(0h～7d)收获白桦细胞,研究细胞干重、三萜积累及防御酶活性的变化。研究结果表明,高温和低温胁迫后均表现在24h～3d收获细胞显著促进了白桦总三萜的合成,且以高温处理效果最佳,48h收获细胞时分别比对照(25℃)和冷胁迫处理提高36.4%和12.87%;而在冷胁迫处理后4d～7d表现显著刺激了总三萜的合成,其中在第7d总三萜的含量比对照增加了22.1%,且两温度胁迫处理后15h～4d显著促进了齐墩果酸三萜的积累,24h收获时,热处理和冷胁迫均比对照提高38.1%和39.65%。两温度胁迫后不同程度促进了超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸裂解酶(PAL)、过氧化物酶(POD)活性提高及丙二醛的积累,但各酶活性出现高峰及变化规律存在差异,明确各酶相互协调、补充是保证细胞适应温度胁迫,减轻自由基伤害,并促进次生产物合成的原因。
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  重组大肠杆菌产Streptomyces sp. FA1来源木聚糖酶的摇瓶发酵优化

  何洁, 宿玲恰, 吴敬

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 41-46.

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  为了实现来源于Streptomyces sp. FA1的木聚糖酶的高效胞外分泌表达,对E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)/coe/xynA基因工程菌的发酵产酶诱导条件进行优化,获得最优的诱导条件为25 ℃发酵6 h后添加终浓度为0.4 mmol/L的IPTG。在此基础上对发酵培养基进一步优化,得到最优培养基成分为:甘油11 g/L,酵母粉24 g/L,蛋白胨8 g/L,磷酸盐浓度89 mmol/L,镁离子4 mmol/L。最终酶活达到780.2 U/ml,为未优化前的2.2倍,是目前大肠杆菌摇瓶发酵产木聚糖酶的最高表达水平,为实现该酶的工业化生产奠定基础。
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  高分子膜载体固定化酵母催化2-辛酮不对称还原

  熊龙斌, 曾虹燕, 何平, 谭奕哲, 刘学英, 张存滢, 蔡西玲

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 47-53.

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  以戊二醛交联尼龙6膜载体固定化面包酵母DX213,采用固定化酵母细胞催化2-辛酮不对称还原得到(R)-2-辛醇。系统考察了有机溶剂、反应时间、pH、底物、辅助底物和热处理等因素对反应的产率和光学选择性的影响。结果表明,上述因素对酵母细胞催化不对称合成(R)-2-辛醇反应均有显著影响。二氯甲烷为该反应最适有机溶剂,在固定化细胞57 g/L(50℃预热50 min),水相与有机溶剂相体积比4/1,pH 7.0,初始2-辛酮浓度为60 mmoL/L(分别在反应0,10,17 h等分添加),蔗糖5.7 g/L和28℃条件下反应48 h,(R)-2-辛醇的产率和e.e.值分别达到89.3%和96.8%。
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  NaCl对轮枝链霉菌产谷氨酰胺转胺酶的促进作用研究

  陈佳, 金明飞, 谭玉静, 刘颖, 田沛霖, 常忠义, 步建国

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 54-58.

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  为了提高轮枝链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的产量,研究了3种无机盐(NaCl、MgCl₂、KCl)对发酵产酶的影响。研究表明0.5%MgCl₂、0.5%NaCl均可促进菌体产酶,其中添加NaCl后谷氨酰胺转胺酶酶活提高最为显著。SDS-PAGE图谱分析显示,在各取样点实验组谷氨酰胺转胺酶酶原和成熟酶的总量高于对照,而且实验组成熟酶的增加也比对照快,从而显示NaCl是通过促进酶原的分泌和谷氨酰胺转胺酶的成熟,从而提高酶活、提早产酶。对NaCl的添加量进行优化,表明NaCl的最适添加量为0.5%,在此条件下,与对照相比,酶活水平提高了12%以上,发酵终点提前了约15h。
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  碳源、氮源对异养单针藻Monoraphidium sp. FXY-10油脂积累和脂肪酸组成的影响

  黄力, 贺赐安, 赵鹏, 余旭亚

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 59-64.

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  研究了碳源与氮源对单针藻Monoraphidium sp. FXY-10异养培养的影响。以BG-11为基础培养基,通过添加不同类型、浓度梯度碳源和氮源,比较分析微藻生物量、油脂积累以及脂肪酸组成。结果表明,以葡萄糖作碳源,硝酸钠为氮源,微藻细胞积累的油脂是理想的生物柴油制备原料。硝酸钠浓度分别为1.00、3.00和5.00 g/L时,对油脂产量影响不显著(P>0.05)。葡萄糖浓度为10.00 g/L,硝酸钠为氮源油脂产量达到实验最高值0.84 g/L,其油脂脂肪酸组成主要由C16:0和C18:1等短链饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸组成,不饱和度值(DU)为61.98,相对偏低。
技术与方法
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  垂体腺苷酸环化酶激活肽衍生多肽RHMP的重组制备及促角膜损伤修复的初步研究

  徐文娜, 马义, 叶祖禄, 罗天杰, 饶磊, 洪岸

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 65-69.

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  利用基因工程技术高效制备具有促进角膜损伤修复功能的垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)衍生多肽RHMP,并在体外研究其生物学效应,为角膜疾病的治疗提供了新思路。采用基因重组技术表达重组肽RHMP,经Chitin-Beads柱纯化、HPLC及SDS-PAGE、质谱鉴定后,研究其对小鼠角膜损伤修复的影响。实验结果表明:利用基因重组技术制备的PACAP衍生多肽RHMP的分子量为3.4kDa,纯度为96%;将重组肽作用于创伤后的小鼠角膜,12h、24h、36h、48h后角膜修复率分别为(49.58±1.74)%、(93.66±3.39)%、(99.6±0.43)%、(99.8±0.14)%,而对照组修复率分别为(9.76±1.58)%、(29.02±1.63)%、(55.10±1.49)%、(78.59±2.52)%,P<0.001,差异具有统计学意义,重组肽RHMP可显著促进小鼠角膜损伤修复。因此,利用以上确立的表达、纯化策略,可实现新型基因重组PACAP衍生多肽RHMP的高效制备,重组多肽RHMP可快速有效地促进损伤角膜的修复,从而有望成为一种新型角膜损伤治疗药物;同时,建立的小鼠角膜上皮损伤模型可用于相关药物的生物学效应研究。
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  兔肌3-磷酸甘油脱氢酶的提纯及性质研究

  王振伟, 李刚锐, 李琳俐, 王帅坤, 孟延发

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 70-76.

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  目的:研究兔肌3-磷酸甘油脱氢酶的分离纯化方法及其酶学性质,为测定血清甘油三酯所用酶联试剂的开发提供试验基础和理论依据。方法:通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose、Blue-Sepharose和羟磷灰石纯化兔肌3-磷酸甘油脱氢酶,利用凝胶过滤和梯度PAGE(5%～15%)法测定酶分子量,采用常规酶学动力学分析方法,考察pH、温度、底物浓度以及部分金属离子与有机化合物对酶促反应的影响。结果 纯化后的兔肌3-磷酸甘油脱氢酶经PAGE(12%)分析为单一条带;酶分子量为115～122 kDa;酶最适温度45℃,最适pH 9;酸碱稳定范围pH6～9,低于45℃时热稳定性好;最适条件下,以3-磷酸甘油和NAD⁺为底物,测得酶的K_m分别为7.4×10^-3mol/L和1.47×10^-4mol/L;Ba²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Ag⁺、Hg²⁺、NaN₃、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Mg²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Zn²⁺有一定程度的激活作用,其中Co²⁺和Zn²⁺对酶的激活作用能达到200%以上,有机化合物NaF对酶的活性没有影响。
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  利用piggyBac转座子制备牛成体多能干细胞诱导技术研究

  赵丽霞, 张金吨, 张健, 李云霞, 苏杰, 孙伟, 赵高平, 戴雁峰, 郭继彤, 胡树香, WANG Wei, LIU Pen-tao, 李喜和

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 77-82.

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  通过逆转录病毒等媒介表达核转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc可将体细胞重编程为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSc)。时至今日,已经报道了小鼠、人、大鼠、猪、羊、马、牛的iPS细胞,但大动物iPS的多能性特别是嵌合体形成和生殖细胞传代还没有得到确认。与逆转录病毒等不同的是,piggyBac转座子转染效率高且无病毒源性、操作简单,可以在转座酶的存在下被安全切除。首次尝试了采用piggyBac转座子携带鼠源Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Rarg和Lrh16个核转录因子诱导胎牛成纤维细胞,成功获得牛类iPS细胞,其形态与小鼠胚胎干细胞相似,克隆边界清晰、呈丘状、克隆内细胞致密、核大。RT-PCR与免疫组织化学染色分析均显示牛类iPS细胞表达多能性基因。该类细胞体外诱导分化可形成类胚体EB,且表达3个胚层的基因;体内诱导分化可形成畸胎瘤,苏木精、伊红染色显示瘤体有三胚层的分化。上述结果显示利用piggyBac转座子制备牛多潜能干细胞诱导技术可行,产生的牛类iPS细胞具有潜在多能性。
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  蛹虫草蓝光诱导两步法发酵产类胡萝卜素

  沈俊良, 金华燕, 高雅, 查美玲, 付鸣佳

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 83-87.

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  采用黑暗摇瓶发酵和蓝光照射静置培养的两步培养法,进行蛹虫草(Cordyceps militaris L.)液体发酵产类胡萝卜素的蓝光诱导。结果表明蛹虫草在2d的黑暗培养和5d的蓝光照射静置培养后,其类胡萝卜素的含量可达到最高值558.4μg/gFW。而以黑暗摇瓶培养2d后,进行不同时间的蓝光照射静置培养。结果表明,蓝光照射最初2d,蛹虫草类胡萝卜素含量变化不明显,随后快速增加,并在第5天达到最大值558.4μg/gFW,随后类胡萝卜素的含量并无明显变化。通过研究解决了蛹虫草液体发酵产类胡萝卜素的培养过程中蓝光的给光问题。
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  生理代谢参数RQ在指导发酵过程优化中的应用

  王萍, 王泽建, 张嗣良

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 88-95.

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  过程在线参数检测是进行发酵过程工程优化控制的基础。呼吸熵RQ是微生物胞内微观代谢流在宏观代谢参数上的响应,反映了微生物培养过程中底物的利用情况、产物和副产物的合成情况、及微观代谢途径通量的变化。结合发酵葡萄糖酸、2,3-丁二醇谷氨酸、柠檬酸、头孢菌素C、毕赤酵母α-干扰素产品的工业生产过程,分析了以微生物胞内微观代谢与宏观的生理参数RQ为指导的发酵工艺优化策略。RQ值在发酵过程中可以根据尾气数据进行在线采集,对指导通过宏观代谢参数的调控来最优化微生物胞内的代谢途经通量,提高目的产物的产率具有非常重要的意义。
综述
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  RANTES衍生物与HIV-1进入抑制剂

  聂伦, 吴文言

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 96-102.

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  HIV-1-1进入抑制剂的研究是近年来艾滋病药物研发领域的新热点,其中最受关注的是以CCR5为靶点的新药研发。CCR5是病毒进入细胞的主要辅助受体,在HIV-1进入宿主细胞过程中起着非常重要的作用。作为CCR5的天然配体,CC类的趋化因子RANTES、MIP-1α和MIP-1β都是极具潜力的HIV-1抑制剂,特别是有关对RANTES的定向设计的研究尤为引人关注,其目的是设计出一种既有很强的抗病毒能力而又不引发炎症反应的HIV-1拮抗剂。就RANTES衍生物应用于抑制HIV进入细胞方面的研究进行了综述。

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  光照对光生物反应器中微藻高密度光自养培养的影响

  李永富, 孟范平, 李祥蕾, 马冬冬

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 103-110.

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  光生物反应器是实现微藻高密度培养的重要装置,其设计的关键技术之一是选择合适的光照方式。根据国内外近十年来的相关研究成果,重点介绍了入射光性质(光源、光强、光质和光暗循环)和光能分布对微藻生长的影响,评述了用于微藻高密度培养的光照技术,展望了进一步的研究方向,为高效光生物反应器的设计和优化提供参考。

专题
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  国际生物经济战略透视

  楚宗岭, 曾海燕, 邓心安

  中国生物工程杂志. 2013, 33(2): 111-116.

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  生命科学与生物技术的发展推动了"生物经济"概念的形成。在对生物经济概念的缘起和演变进行系统梳理的基础上,对国际生物经济战略与政策动态进行了全景式扫描和综合分析,归纳出生物经济战略所共有的主流特征。这些特征包括:生物经济发展领域涵盖广,多方位促进经济绿色转型;以可持续为指归,形成迈向可持续未来的综合平台;将生物质作为驱动生物经济的基础资源,重视加强创新技术的研发。