中国生物工程杂志

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邹正渝, 王海燕, 黎玉叶, 孙双双, 叶立伟, 武睿, 段亮, 陈娴, 罗进勇, 周兰

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 1-7.

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目的:制备重组hS100A6蛋白,并研究其对人骨肉瘤细胞系143B的生物学作用。方法:构建pGST-HRV3C-hS100A6质粒,经转化至E. coli BL21,IPTG诱导表达融合蛋白GST-HRV3C-hS100A6,经超声破菌,谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠纯化,GST-HRV3C酶切,再纯化,Western blot鉴定,分光光度法蛋白定量。以人骨肉瘤细胞系143B为研究对象,MTT检测细胞增殖,Hoechst检测细胞凋亡,Transwell检测细胞迁移和侵袭,Western blot检测hS100A6对β-catenin表达的影响。结果:成功制备重组hS100A6蛋白,测得该蛋白产量约为4mg/L菌液。30μg/ml重组hS100A6促进143B细胞的增殖、迁移、侵袭以及β-catenin的表达(P<0.05),对143B细胞的凋亡无明显影响(P>0.05)。结论:成功制备重组hS100A6蛋白,30μg/ml重组hS100A6蛋白对143B细胞有一定的促进作用。

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shRNA抑制c-fos表达对P-gp介导的乳腺癌多药耐药的影响

师锐赞, 胡晓玲, 范彦英

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 8-12.

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多药耐药 (multidrug resistance, MDR)是导致化疗失败的重要原因,多药耐药基因(multidrug resistance gene, mdr1)产物P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)过表达是最主要的耐药机制。原癌基因c-fos在肿瘤MDR中的作用渐受重视。主要选用人乳腺癌敏感株MCF-7和阿霉素(adriamycin, ADR)筛选的、mdr1/ P-gp高表达的耐药株MCF-7/ADR,探讨c-fos在P-gp介导的乳腺癌MDR中的作用。相对于MCF-7,c-fos在MCF-7/ADR高表达。采用shRNA法下调c-fos表达后,MCF-7/ADR对ADR的敏感性大大增强,且mdr1/P-gp表达减少、P-gp外排功能降低。c-fos表达下调可逆转对P-gp介导的乳腺癌MDR的实验结果,为c-fos成为逆转肿瘤耐药诊断和治疗的新靶标,对实现耐药乳腺癌的分子靶向治疗提供了理论基础。

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化脓链球菌中铁结合蛋白MtsA二级结构的研究

王红翠, 张静, 徐倩, 许丽娜, 王南杰, 孙雪松

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 13-19.

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化脓性链球菌是一种革兰氏阳性人类致病菌,其生长和感染离不开铁离子。MtsA是化脓链球菌中直接结合铁离子的一个脂蛋白。通过PCR扩增化脓性链球菌MGAS5005中的MtsA基因,构建高效表达质粒pGEX-MtsA,将其转化到大肠杆菌BL21中并用IPTG进行诱导表达。利用亲和层析方法纯化表达产物。通过多序列比对分析了MtsA铁结合中心的保守性,利用定点突变技术将MtsA的结合配体单位点及多位点进行突变,结合圆二色谱分析这些氨基酸突变后蛋白二级结构的变化。多序列比对结果表明MtsA结合铁离子的氨基酸位点是保守的,4个关键氨基酸位点处于蛋白空间的凹陷处。通过比较空载及饱和铁离子的野生型蛋白以及突变体蛋白的圆二色吸收光谱,发现野生型MtsA结合铁离子后结构更加紧密,H68A, E206A 和 D281A则比野生型的二级结构松散,而H140A的二级结构和野生型的几乎没有差别。对MtsA 4个结合配体突变后其二级结构变化的研究,为进一步研究细菌中的铁转运机理及开发疫苗候选药物和药靶奠定了一定的理论依据。

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牛呼吸道合胞体病毒核蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

马磊, 朱远茂, 蔡红, 王姝, 史鸿飞, 吕闯, 董秀梅, 高欲燃, 薛飞

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 20-24.

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利用牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)接种牛肺细胞(BL),提取病毒RNA。通过RT-PCR扩增BRSV的核蛋白基因,然后定向克隆到原核表达载体pET30a,获得重组表达质粒pET30a-N。将重组质粒转化表达菌BL21(DE3),经增菌培养和IPTG诱导以及SDS-PAGE和Western blot分析,成功表达出了核蛋白(N),其分子量约为49kDa。为制备BRSV核蛋白的单克隆抗体,用纯化的重组核蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与 SP2/0细胞融合。采用以BRSV为检测抗原的间接ELISA筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得2株稳定分泌抗N特异性MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2D12与4B10。用2D12与4B10杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠制备腹水,采用rN及BRSV包被的ELISA测得的效价分别是1×10⁵和1×10⁶及1×10²和1×10³。间接ELISA、Western blot、IFA试验表明两株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性。经抗体亚类鉴定D12与4B10均为IgG1/κ。特异性试验表明单抗2D12与4B10均不与牛副流感病毒3型和牛病毒性腹泻病毒反应。所制备的D12与4B10可用于建立检测BRSV病原及抗体的诊断方法。

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LSD1通过和Oct4/Nanog相互作用调节诱导多能干细胞的形成

孙昊, 卢存福, 郭允倩

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 25-29.

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将4个转录因子Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc转入成纤维细胞可以生成诱导多能干细胞(iPS细胞),转录因子和染色质修饰因子在这个过程中起重要作用。LSD1作为染色质结构的调节因子,在早期胚胎发育和ES细胞分化中发挥着关键作用。为了探索LSD1在iPS细胞产生过程中的作用,首先比较了LSD1蛋白在MEFs和ES细胞中的表达量,然后分别通过在重编程体系中过表达LSD1、加入RNAi和抑制剂的方法探索LSD1的功能,最后用免疫共沉淀的方法初步发现LSD1的作用机制。结果表明,LSD1在ES细胞中的表达量高于MEFs中,过表达LSD1对iPS细胞的形成效率没有影响,而RNAi抑制LSD1的表达和LSD1抑制剂tranylcypromine都能促进iPS细胞的形成。免疫共沉淀实验表明LSD1和Oct4/Nanog有相互作用。这些数据说明LSD1通过和Oct4/Nanog相互作用调控iPS细胞的形成。

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动物双歧杆菌肌球交叉反应抗原MCRA酶学功能的研究

杨波, 陈海琴, 宋元达, 张灏, 陈卫

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 30-36.

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目的:将肌球蛋白交叉反应抗原基因(Myosin cross reactive antigen, MCRA)在毕赤酵母中重组表达,对其酶学功能进行研究。方法:利用动物双歧杆菌BB-12(Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12)的肌球交叉反应抗原(MCRA)基因序列特征设计引物进行PCR扩增后克隆至毕赤酵母表达载体pPinkα-HC,电转化获得PichiaPink^TM重组菌。通过SDS-PAGE和Western blot检测重组蛋白的表达情况,GC-MS分析重组菌的脂质组成情况,最终确定重组蛋白的活性及其催化特性。结果:SDS-PAGE及Western blot结果表明动物双歧杆菌BB-12的MCRA蛋白在重组毕赤酵母菌PichiaPink^TM pPinkα-HC-MCRA中成功表达且定位至细胞膜,大小为82 kDa。GC-MS结果显示,添加底物亚油酸培养基后,重组菌将亚油酸转变为羟基化衍生物,产物为10-羟基-顺-12-十八碳烯酸(10-HOE)。结论:这是首次对该类蛋白成功定位后对其酶学功能进行研究,动物双歧杆菌BB-12的MCRA基因首次在毕赤酵母中实现了活性表达,产物为10-羟基-顺-12-十八碳烯酸。

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毕赤酵母高效分泌长效人生长激素的研究

戚楠, 张艳红, 吴军, 马清钧

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 37-46.

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目的:为了延长人生长激素(HGH)在血浆中的半衰期,构建了高效分泌表达人血清白蛋白(HSA)与HGH融合蛋白(HSA-HGH)的工程毕赤酵母菌株。方法:从人胎肝cDNA文库中扩增HSA基因,从HGH工程菌载体中扩增HGH基因,将其克隆至真核表达载体pHIL-D2,载体线性化后采用电击法转化毕赤酵母GS115。通过原位双层膜法筛选高效分泌表达菌株。分别采用SDS-PAGE和Western印迹鉴定融合蛋白。对工程酵母培养条件进行研究,发酵液经离子交换层析、亲和层析和分子筛层析纯化。纯化的蛋白经N端序列测定,分子量测定和等电聚焦电泳进行鉴定。冻干的蛋白制剂经食蟹猴试验进行药代动力学和药效动力学测试。结果:确立了工程酵母的最佳培养工艺,融合蛋白表达量达100mg/L。纯化后蛋白纯度达95%以上,得率达42%。融合蛋白与预期结果一致,经食蟹猴试验,显示有良好的生物活性,与等摩尔剂量的重组人生长激素相比,半衰期延长6.8倍,清除率慢44倍。结论:融合蛋白呈现明显的长效动力学特征,为开发重组长效人生长激素HSA-HGH融合蛋白药物(rHSA-HGH)奠定了基础。

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重组卡介苗HSP65抑制小鼠移植黑色素瘤的初步药效学研究

谢燕飞, 陈檬, 彭淑红, 汤啸天, 舒青龙, 左爱仁, 曹荣月

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 47-51.

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观察卡介苗来源的热休克蛋白HSP65对小鼠移植黑色素瘤的抑制作用并初步探讨可能的作用机制。通过基因工程手段获得纯化的重组HSP65蛋白,与弗氏佐剂联合给药C57BL/6J小鼠。分别设计了两组免疫方案,一组于肿瘤细胞接种前免疫3次,另一组于肿瘤细胞接种前免疫7次。结果在免疫3次的情况下,虽然也能激发较高的特异性抗HSP65抗体,但抑瘤效果不明显(抑瘤率14.2%);增加免疫次数到7次后,抑瘤率高达73.2%,效果显著。经肿瘤组织病理切片发现,增加免疫次数导致肿瘤组织中灶性坏死增加,淋巴细胞浸润增加,且肿瘤细胞病理性核分裂相减少,提示了该疫苗作用的可能机制。

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导入八氢番茄红素合酶和番茄红素β-环化酶基因的玉米后代性状分析

杨秋玲, 季静, 王罡, 武卫党, 霍培

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 52-58.

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以分别转有枸杞八氢番茄红素合成酶基因Lmpsy和枸杞番茄红素β-环化酶基因Lmlycb的两种转基因的天塔五号自交系玉米植株为转基因材料,以非转基因的天塔五号自交系为对照组,对它们的光合速率,类胡萝卜素含量,植株性状,产量相关指标及生物量进行了调查和统计学分析。结果表明将类胡萝卜素代谢途径关键酶的基因导入天塔五号自交系植株,能提高植株类胡萝卜素的表达量,消除光污染,提高光合速率,增加光合产物的积累量。

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响应面分析法优化豆粕固态发酵工艺生产大豆抗氧化肽的研究

陈洁梅, 徐聪聪, 常磊, 刘永萍, 缪冰旋

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 59-65.

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分别以总抗氧化活性(T-AOC)和多肽含量为评价指标,通过单因素实验分析和Box-Behnken响应面分析法对豆粕固态发酵工艺条件进行优化,得到最佳发酵工艺条件为:接种量9.6%,料水比1:0.9,发酵温度35℃。豆粕在此条件下发酵48h,其总抗氧化活性与多肽含量分别由发酵前的207.2U/g和21.0mg/g提高到1091.1U/g和347.7mg/g,分别提高了4.3倍和15.6倍,与预测值相比,结果吻合性良好。总抗氧化活性与多肽含量的相关性良好(R²=0.8604),表明得到的多肽为抗氧化肽。

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产油微藻筛选和鉴定及其产油性能的研究

胡文军, 罗玮, 李汉广, 顾秋亚, 余晓斌

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 66-72.

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为了筛选具有产油能力的微藻,从自然界水体中分离出14株微藻,根据形态特点对它们进行了初步鉴定。对其中12株微藻在自养和异养条件下的生长特性和产油性能进行了比较。通过微藻的生长曲线,生物量和油脂含量等指标,从中筛选出高产藻株并对该藻株进行了分子生物学鉴定。结果表明:藻株Y06在12种微藻中的油脂产量和产率最高,经18S rDNA鉴定确定为栅藻(Scenedesmus abundans)。藻株Y06在自养条件下的油脂产率为9.40 mg/(L·d),在异养条件下的油脂产率为201.29 mg/(L·d)。

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慢病毒载体导入种蛋内鸡胚技术研究

燕海峰, 易康乐, TREFIL P, 胡雄贵, 邓缘, 朱立军

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 73-79.

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种蛋内鸡胚含有潜在的胚胎干细胞(BCs)或原生殖细胞(PGCs),是目前主要的转基因鸡研究方法。采用绿色荧光蛋白(GFP)基因的pLenti6/v5-DEST-GFP慢病毒表达载体,白来航鸡与伊萨鸡种蛋,结合种蛋赤道面开窗专利技术,对含这两种细胞胚的转基因技术进行了比较研究:转染白来航鸡囊胚,孵化13天时,GFP基因的PCR检出率为64.7%,孵化率极低;转染孵化72h伊萨鸡胚血液循环中PGCs,实验蛋孵化率为35.0%,在出壳后死亡的3只小鸡肝脏中,GFP基因的PCR检出率为100%,存活的4只鸡中有3只在12月龄的血液样品中,经PCR扩增出了GFP基因;转染孵化72~79h白来航鸡胚PGCs,7批次实验的平均孵化率为21.1%,能在赤道面窗口注射胚的种蛋比率,以73~77h胚龄的最高,为75.0%~92.9%,注射病毒组出壳雏鸡血液DNA中,GFP基因PCR检出率为44.4%。两种方法比较,PGCs方法在实验蛋孵化率、胚定位在赤道面窗口率等方面有较强优势。因此为种蛋内胚细胞的转基因鸡技术研究提供了系统、可操作性强的方法。

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鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法

李富威, 张舒亚, 任硕, 张瑞灏, 蒋羽, 顾顺樟, 葛辛, 张磊, 包建强

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 80-85.

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研究建立了鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法。依据鳕鱼的16S rRNA 基因序列设计一对PCR 引物及探针,对12种鳕鱼样品和71种非鳕鱼动植物样品进行实时荧光PCR检测,结果显示,只有12种鳕鱼样品产生荧光信号,其他非鳕鱼样品均不产生荧光信号,实验表明此方法具有特异性,其检测限为0.01 ng/μl鳕鱼DNA和0.01%鳕鱼肉粉。对市售的鳕鱼样品进行实际样品检测,均能很好地检出鳕鱼成分。此法特异性强,灵敏度高,可作为鳕鱼成分鉴定的检测方法。

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Toll样受体对病原真菌的天然免疫识别

何小兵, 贾怀杰, 景志忠

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 86-92.

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天然免疫系统是宿主抵御病原入侵的第一道防线,在机体抗感染免疫中发挥重要作用。Toll样受体 (Toll-like receptors, TLRs)是天然免疫系统最重要的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)之一,通过识别病原真菌的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),招募特异接头蛋白,激活一系列信号级联反应,引发炎症因子、趋化因子等的释放和树突状细胞(dendritic cells, DCs)的成熟,发挥抗真菌感染作用。通过简要介绍宿主的TLRs及信号通路的研究进展,总结了目前TLRs对不同病原真菌PAMPs的天然免疫识别及信号通路研究现状, 以期对进一步研究宿主天然免疫系统与病原真菌相互作用的分子机制提供参考。

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亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用

陈爱春, 彭伟, 汪生鹏

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 93-103.

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亲和标签融合技术为重组蛋白的纯化提供了一种简单方便的纯化工具,具有结合特异性高、洗脱条件温和、通用性强、纯化倍数高等显著优点。概述了亲和标签对融合蛋白表达的影响,可以提高重组蛋白的产量,增强重组蛋白的可溶性,促进重组蛋白的正确折叠;回顾了在重组蛋白表达与纯化中广泛使用的几种亲和标签,以及近年来相继出现的几种比较新颖的纯化标签;介绍了亲和标签的组合使用策略,His₆-MBP组合标签集合了两个标签的优点,串联亲和纯化可以纯化获得生理条件下的蛋白质复合体;展望了亲和标签未来的发展趋势,认为仍需继续开发性能更加优越、纯化效果更加显著的纯化标签系统。

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分子拥挤条件下生物大分子性质研究

张玉姣, 唐乾, 曹洪玉, 郑学仿

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 104-109.

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细胞中成千上万种生物分子以不同的浓度发挥着各自的生理作用,但是体外研究中常常忽略细胞内的拥挤环境,随着分子拥挤理论的提出,体外添加大分子拥挤试剂被越来越多的生物学家和化学家所重视,众多的研究结果显示分子拥挤试剂的加入对细胞内的生物大分子的性质造成了一定的影响。从分子拥挤试剂对蛋白质折叠与聚集以及核酸分子结构与性质的影响等方面探讨了拥挤环境下生物大分子的性质和功能,为以后大分子拥挤条件下生物分子的研究提供一定的参考依据。

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微生物信号分子降解酶研究进展

赵晶, 权春善

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 110-116.

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微生物细胞之间存在的信息交流称为群体感应。群体感应在实现微生物的生物学功能方面具有重要作用,包括调节致病性、参与生物膜的形成等。微生物能够分泌特定的信号分子,通过对信号分子的检测及应答,调控目的基因的表达。抑制信号分子的积累,能够干扰群体感应系统,使微生物丧失生物学功能。研究较为全面的一类信号分子是酰基高丝氨酸内酯(acylhomoserine lactone, AHL),此类信号分子可以通过酶法降解。目前已鉴定出的AHL降解酶主要分为AHL内酯酶和AHL酰化酶两类。综述了信号分子降解酶的来源、筛选方法、纯化技术、酶学性质、作用机制及在病害防治方面的应用。对信号分子降解酶的研究有助于完善群体感应系统的调控机制,并为微生物疾病的防治提供新策略。

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固碳产油微藻的基因工程改造

于水燕, 赵权宇, 史吉平

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 117-124.

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藻种的选育和基因工程改造是微藻生物柴油研究的核心。为此,简要综述了微藻从光合作用到甘油三酯(TAG)合成过程中的关键基因及其代谢调控等方面的研究进展。从光合作用固碳、中心碳代谢、脂肪酸合成、TAG的组装、抑制TAG合成的竞争途径及脂类的分解途径等几个方面入手,浅析各个代谢途径中关键基因的作用及其表达调控。在此基础上,探讨微藻基因工程改造的可行性并指出微藻生物柴油在生物质能源领域中的前景及其综合利用的发展优势。

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固相反硝化技术同时去除地下水中的硝酸盐与农药进展

王旭明, 孙立娇, 仇天雷, 张兰河

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 125-129.

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概述了固相反硝化技术及其特点,综述了固相反硝化技术在去除地下水中硝酸盐与农药的研究现状,分析了反应机理及当前研究中存在的问题,并在此基础上对固相反硝化的未来核心研究方向进行了展望。

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光合细菌处理废水过程中生物产氢技术研究进展

赵微, 张光明

中国生物工程杂志. 2012, 32(12): 130-135.

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光合细菌(PSB)生物产氢技术能够将光能利用、氢能制备和废水中有机物的去除有效地结合在一起,是一种极具发展潜力的氢能生产技术。分析了PSB利用废水生物产氢的机制与具有产氢活性的代表性PSB,总结了PSB生物产氢主要影响因素与技术,指出目前该项研究存在的问题,并对其应用前景进行了评述。

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2012年, 第32卷, 第12期　
刊出日期：2012-12-25

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