PSF(polypyrimidine tract binding protein-associated splicing factor)蛋白是一种多功能的DNA/RNA结合蛋白,能够抑制原癌基因的表达,在人和小鼠中具有肿瘤抑制的作用。以人成纤维细胞总RNA为材料,利用PSF特异性引物通过RT-PCR的方法扩增得到PSF蛋白的编码序列,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中构建重组表达质粒pET-28-PSF,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。SDS-PAGE及免疫印记分析表明PSF能够在大肠杆菌中以可溶性形式表达。凝胶阻滞分析显示,原核表达的PSF融合蛋白在体外条件下能够与mVL30-1 RNA结合,表明PSF的原核表达产物很可能具有完整的生物学活性。为进一步研究PSF蛋白的生物学功能奠定了基础。
通过移植生物材料到小鼠体内而建立一种新的干细胞获取方法。移植明胶海绵到小鼠后肢的大腿内侧肌间隙,12天后分离明胶海绵中的迁移细胞。海绵来源干细胞形态、增殖能力、多向分化能力与骨髓源干细胞相似,但海绵中成纤维细胞集落形成单位的比例 (82.2±10.6/105) 远远高于骨髓中的比例 (43.7±7.4/106) (P<0.05)。此外,骨髓移植实验证实了迁移细胞中的干细胞来源于外周循环血,而且这种方法可以实现自体细胞治疗,因此有潜力应用于临床。
猪、牛、人血红蛋白或其相应的戊二醛聚合体分别经皮下或腹腔多次免疫小鼠,ELISA检测抗血清IgG滴度;免疫印迹法分别检测小鼠抗猪、牛、人血红蛋白或其相应的戊二醛聚合体IgG与猪、牛、人血红蛋白或其相应的戊二醛聚合体之间的交叉反应,探讨戊二醛聚合对不同种类血红蛋白免疫学特性的影响。结果表明:猪、牛、人血红蛋白的免疫原性均很弱,其相应的戊二醛聚合体免疫原性明显增强; 猪、牛、人血红蛋白具有明显的抗原性差异;戊二醛聚合对这三类血红蛋白免疫学性质的影响完全不同,戊二醛聚合猪血红蛋白没有产生新的抗原决定簇,戊二醛聚合牛血红蛋白某些抗原决定簇被封闭,戊二醛聚合人血红蛋白形成了某些新的抗原决定簇。
目的: 研究壳寡糖对甲萘醌诱导的巨噬细胞氧化损伤的保护作用。方法: 通过MTT实验检测相应处理的细胞活力,并通过相应试剂盒检测细胞氧化还原体系中某些相关酶的活力及相应产物含量。结果: 壳寡糖能够缓解甲萘醌诱导的细胞损伤,并且发现壳寡糖可以缓解甲萘醌导致的胞内超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力的降低,以及抑制相应的脂质过氧化反应产物(MDA)的产生,表明壳寡糖可能通过此机制来抵制甲萘醌导致的氧化损伤。结论: 壳寡糖可以缓解甲萘醌诱导的细胞氧化损伤。
垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)特异受体PAC1(normal型)N端胞外域 具有调控PAC1活性的作用。为研究PAC1-EC1(N)对表达不同PAC1变体的细胞系活性的影响,利用基因工程技术获得C端带有6个his纯化标签的重组PAC1-EC1(N)。质谱检测、SDS-PAGE电泳和Western blot检测结果均显示成功表达和纯化目的蛋白PAC1-EC1(N)。Western blot检测确定兔眼角膜基质细胞、人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、人前列腺癌细胞22RV1中分别表达一个或多个分子量不同的PAC1变体。重组PAC1-EC1(N)作用3株细胞,MTT方法检测细胞活性,结果显示:PAC1-EC1(N)有效促进只表达一个小分子PAC1变体的兔眼角膜基质细胞的增殖;但显著抑制只表达一个大分子PAC1变体的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的活性。对于表达3种大小不一的PAC1变体的人前列腺癌细胞22RV1,PAC1-EC1(N)对细胞的活性具有复杂的调控。显示PAC1-EC1(N)对表达PAC1变体数量不同,类型不同的细胞具有不同的生物活性的作用,提示了PAC1变体可能具有较复杂的自我调控机制。
G1到S期的转换是植物细胞周期中一个关键的调控点,而D型细胞周期蛋白(CYCD)在这一转换过程中起着重要作用。CYCD通过感受外界信号的刺激,调控细胞周期进程,进而影响植物的生长发育。为研究木本植物中不同CYCD基因家族的功能,从黑杨中克隆出6个CYCD基因,并将其转化至酵母G1期细胞周期蛋白突变体进行功能鉴定。各家族CYCD基因均能对酵母突变体进行回补,但回补后促进酵母生长的能力存在差异。通过对黑杨组培苗进行糖和植物激素处理,观察到黑杨根部形态发生改变,同时用实时荧光定量PCR技术检测了该处理条件下CYCD基因表达量的变化。结果表明,各CYCD基因家族的代表成员对糖和植物激素的响应不同,反映了不同黑杨CYCD基因在树木生长发育过程中所起作用的差异性。
虽然表达序列标签(ESTs,mRNA片段序列)已广泛用于高效基因发现和补充基因组注释的工作,最近,与实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)结合, 它也开始应用于种系遗传学、转录谱及其蛋白组学方面。通过对油料木本植物小桐子(J. curcas)的生殖组织基因表达水平的分析,预期可能找到一些与油脂合成相关的基因。这些研究成果在将来可能用于提高种子产油木质类植物的油产量。为此,分别构建了两个cDNA文库,一共得到9289条平均长度为603bp的EST序列。这些序列经过组装得到4502条独立基因序列(UniSeqs),分别包括1427条重叠群(包含1条以上EST序列)和3075条单一序列(包含1条EST序列)。用Gene Ontology(GO)分类软件对这些组装的序列进行了基因注释, 并利用qRT-PCR对其中50条EST序列在叶子,花和种子中的相对表达水平进行了定量分析,发现在两个cDNA文库中有6条高丰度的EST序列(Contig1452, Contig1482, Contig1510, Contig1514, Contig1534和Contig1535)在一或两个小桐子组织中也是高表达。这些基因编码高表达的油脂合成相关蛋白或者转录因子。此实验为小桐子的基因组注释及其在增加公共数据库内储备序列的数量方面提供了EST序列。尤其是实时荧光定量反转录PCR分析验证的6条在cDNA文库中频繁出现的,高丰度的,具有推定功能的EST序列,特别是qRT-PCR检测出的与油脂合成或转录因子相关的EST编码基因群可能在小桐子的油脂合成中起着重要的作用。
为了解AGM3基因在异源植物中对开花及花器官发育的影响,采用农杆菌介导法将dominant negative mutation(DNM)结构基因35S-AGM3-E9导入烟草(Nicotiana tabacum),经PCR和Southern检测获得了一批阳性转化植株。荧光定量分析结果显示,AGM3在各个转基因株系中均有表达,且不同株系间表达量差异极显著。调查结果分析表明:与野生型植株相比,46.7%的转基因株系未成花,33.3%的转基因株系开花时间平均推迟29.7天,20%的转基因株系开花时期与野生型相同。对花器官形态的观察发现,转基因烟草出现花萼数目减少、花冠产生深裂、花瓣和雄蕊形状改变、雄蕊数目增多或减少等变异。这些研究结果表明35S-AGM3-E9有效地抑制了花的发育,为利用转基因手段获得不育材料的研究奠定了基础。
目的:对前期构建的深海宏基因组文库克隆子发酵产物进行生物活性筛选。方法:利用CCK8法及琼脂扩散法和双层琼脂法进行了细胞毒活性及抗菌活性筛选,利用荧光定量PCR法进行了抗乙肝病毒活性筛选。结果:筛选发现3个具有细胞毒活性的混合克隆子。HPLC指纹图谱分析表明这3个混合克隆子具有与大肠杆菌宿主对照不同的指纹图谱,其活性与出现的指纹峰成分可能相关。结论:研究结果提示对深海宏基因组文库克隆子发酵产物进行化学筛选为常规的生物活性功能筛选之外的有意义途径。
蓝藻NADPH脱氢酶(NDH-1)是一种重要的光合膜蛋白复合体,参与CO2吸收、围绕光系统I的循环电子传递和细胞呼吸。迄今为止,人们在蓝藻细胞中已鉴定出17种NDH-1复合体亚基(NdhA-NdhQ)。最近,人们还获得了NdhO亚基的缺失突变株。然而,人们对NdhO亚基的研究还不充份,至今仍不清楚它的功能角色。通过PCR扩增出集胞藻6803 NdhO亚基编码基因ndhO,构建表达质粒pET32a(+)-ndhO,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导表达、经His-tag纯化后免疫日本大耳白兔获得多克隆抗体。间接ELISA法揭示NdhO抗体效价可高达1 ∶ 1 025 000;蛋白免疫印迹确定该抗体具有高度特异性。应用该抗体进行蛋白免疫印迹检测,结果发现NdhO亚基仅存在于NDH-1活性复合体中。因此,NdhO多克隆抗体的获得将为进一步阐明该亚基所担任的功能角色奠定了生化基础。
油菜秸秆含有大量木质纤维素,该类物质结构稳定,不易降解,限制了其工业化应用。通过对10株包括细菌、酵母菌和白腐真菌的菌株产酶能力和特性进行比较,并进行共同培养试验,筛选出5株可共同生长的木质纤维素降解菌BS09、BL、PC、TS和KS。通过对这5个菌株单独发酵降解油菜秸秆的能力考察,结果表明:PC对木质纤维素的降解能力最强,其木质素降解率达到16.5%,纤维素和半纤维素降解率也达到了22.7%和20.3%;BS09和BL对纤维素和半纤维素降解效果较为明显,纤维素和半纤维素降解率分别达到19.5%、15.0%和16.0%、22.1%。
甘油脱水酶是甘油转化3-羟基丙酸生物合成途径中的关键性限速酶,然而底物甘油的存在会抑制该酶的活性,从而引起3-羟基丙酸合成量的下降。因此解除底物甘油对甘油脱水酶活性的抑制作用,是提高生物合成3-羟基丙酸产量的方法之一。克隆来源于克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶编码基因dhaB、甘油脱水酶再激活因子编码基因gdrA、gdrB,以及来源于酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae W303)的乙醛脱氢酶编码基因aldH,分别构建了基因工程菌Escherichia coli JM109/pEtac-dhaB-tac-aldH和E. coli JM109/pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH,考察甘油脱水酶再激活因子对3-羟基丙酸生物合成的影响。在好氧条件下发酵28小时, E. coli JM109/pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH与E. coli JM109/pEtac-dhaB-tac-aldH3-羟基丙酸合成量分别为4.0 g/L 和0.54 g/L,前者与后者相比,3-羟基丙酸合成量提高了6.4倍。研究结果表明,甘油脱水酶再激活因子能有效激活甘油脱水酶的活性从而提高了目标产物3-羟基丙酸的生物合成量。
产NDM-1(New Delhi Metallo-β-lactamase 1, I型新德里金属β-内酰胺酶)细菌是新近报道的一种泛耐药细菌,由于对绝大多数常用抗生素均耐药,又被称为超级细菌。目的:建立一种可快速检测泛耐药细菌NDM-1基因的Taqman探针实时荧光定量PCR法。方法:根据NDM-1基因序列,设计引物和Taqman探针,建立Taqman探针实时定量PCR检测方法,对方法的敏感性、重复性和特异性进行了评价,并对临床模拟标本中的产NDM-1细菌进行了检测。结果:该方法在9个浓度(5×100~5×108拷贝)梯度范围内呈现很好的线性关系,检测灵敏度可达5个质粒拷贝,与不含NDM-1基因的肠杆菌无交叉反应,对尿液模拟标本的检出限为10 CFU,可快速准确地检出临床样本中分离的NDM-1阳性菌株。结论:建立的Taqman探针实时荧光定量PCR法具有快速、简单、灵敏度高和特异性强等优点,可应用于临床上泛耐药细菌NDM-1基因的核酸检测。
目的:采用一种简便方法在复制缺陷型腺病毒载体纤突结(fibre knob)的HI loop插入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartate,RGD)肽,构建纤突结修饰的腺病毒载体,观察其对RD和T24肿瘤细胞的感染效率以及机体针对外源基因的抗体反应。方法:以PCR方法将RGD插入到pAdEasy-1后,通过常规方法构建可表达EGFP和人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial viruse, RSV)密码子优化型融合蛋白(fusion protein, Fsyn)的腺病毒载体FGAd-RGD-EGFP和FGAd-RGD-Fsyn。用FGAd-RGD-EGFP感染RD和T24肿瘤细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测感染效率,用FGAd-RGD-Fsyn免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测针对外源基因的抗体反应。结果:与FGAd-EGFP相比,FGAd-RGD-EGFP对RD和T24肿瘤细胞的感染效率都有显著提高,EGFP表达效率也明显增强。与FGAd-Fsyn相比,FGAd-RGD-Fsyn所引起的机体针对外源基因的抗体反应并无差异。结论:改造后的腺病毒载体能显著提高对RD和T24肿瘤细胞的感染效率,但并不引起机体产生针对外源基因的增强的抗体反应,该载体能用于肿瘤等疾病的基因治疗研究。
聚合酶链式反应(PCR)作为常规分子克隆技术已在分子生物学的各个领域得到广泛应用。然而,多重PCR技术应用于质粒拷贝数检测的研究尚未见报道。为深入探索多重PCR在质粒拷贝数测定中的应用,首先利用构建的多重PCR引物设计及评估体系分别针对细菌基因组DNA和质粒载体DNA序列设计多重PCR引物;然后以转化有不同质粒载体的大肠杆菌菌液为模板进行多重PCR反应;最后利用凝胶成像仪采集图像后进行积分光密度分析以获得质粒的相对拷贝数。结果显示通过多重PCR得到的质粒相对拷贝数与Real-time PCR和Southern blot的检测结果基本一致,说明多重PCR可用于质粒拷贝数的定性检测。利用多重PCR技术建立了一种便捷的质粒拷贝数检测方法,为在宿主细胞中快速确定克隆载体或表达载体的相对含量提供了参考。
目的:枯草杆菌的包装RNA分子pRNA是新型纳米分子载体,将其同锤头型核酶Ribozyme重组可以构建结构稳定、能进入细胞、主动识别结合和剪切基因RNA的pRNA-Ribozyme。由于目前100 nt以上的RNA分子采用化学合成制备较为困难,实验采用基因重组构建并体外转录制备170 nt的pRNA-Ribozyme。方法:依据pRNA序列和Ribozyme分子序列,采用PCR扩增和克隆重组,将pRNA-Ribozyme按照顺式连接开放式结构、和Ribozyme嵌入pRNA成自身环化闭合型结构,制备其DNA质粒;再在体外转录制备pRNA-Ribozyme分子。结果:体外生物合成制备pRNA-Ribozyme顺式连接开放式结构、和Ribozyme嵌入pRNA成自身环化闭合型结构pRNA-Ribozyme分子,它们能通过自身正确折叠形成聚合体结构。体外鉴定pRNA-Ribozyme对其靶mRNA均具有切割降解活性,为pRNA-Ribozyme分子的细胞内应用和在胞内表达应用打下基础。
利用4-溴丁酸乙酯对小分子半抗原己烯雌酚(DES)进行活化,引入羧基活性基团,应用活泼酯法将其与牛血清白蛋白(BSA)偶联,合成DES-CP-BSA完全抗原,免疫新西兰长耳白兔,制备特异性抗体。结果显示:成功制备了DES完全抗原,且由此获得了特异性的DES抗体,效价达1.28×105,与己烷雌酚、双烯雌酚的交叉反应分别为9.3%和1.1%,与雌二醇无交叉反应。在此基础上建立了间接竞争ELISA检测方法,IC50为7.0 ng/ml,检测限达0.3 ng/ml,可以满足动物性食品中DES残留检测的需要。
腺病毒载体是基因治疗的常用载体之一,已经广泛应用于肿瘤和遗传疾病等的基因治疗研究中。但是临床发现腺病毒载体有较高的免疫原性,同时缺乏组织或细胞特异性,制约了其在临床上的应用。通过共价键结合或者静电力作用,将高分子修饰到病毒衣壳上,利用高分子的特殊性质可以降低载体的免疫原性和提高载体的靶向性,同时载体保持了较高的转染能力。主要综述了近年来采用高分子对腺病毒载体进行修饰的研究进展。
细胞中大多数蛋白质以亚基形式与其他蛋白装配成蛋白复合体而发挥功能。大分子蛋白复合物的结构研究和功能分析在后基因组时代成为热点,如何高效地获得多蛋白复合物是研究其功能和结构的前提。利用基因工程技术实现多个蛋白亚基在同一宿主细胞内共表达并装配成复合体是获得多蛋白复合物的有效手段。多基因表达系统在基础和应用研究中正起到越来越重要作用。多基因表达系统研究发展迅速,尤其在近5年内取得较大进步。对各种多基因表达系统进行了总结。同时介绍了不同多基因表达系统的构建策略和构建方法,并对最新的多基因表达载体构建和多基因表达系统的初步应用进行了介绍。多基因表达系统将在作物改良、疫苗制备、基因治疗和药物开发方面发挥更大作用。
分子探针应用于细胞凋亡检测具有直观、无创伤和实时动态观察凋亡分子信息的特点,在疾病早期诊断、监测疾病发展进程、评估疾病治疗效果、发展新的治疗方案等方面具有较好的应用前景。综述了近年来靶向细胞凋亡探针的设计、作用机制、应用等相关的研究进展,并根据亲和组件的作用机制对分子探针进行分类介绍。
关节软骨自我修复能力有限,目前临床用于治疗关节软骨损伤的方法和药物均难以达到满意的效果。间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便等特点,可能成为软骨组织工程的理想种子细胞之一。就间充质干细胞在软骨表型分化方面的研究进展进行了综述。系统地介绍了影响间充质干细胞向软骨细胞分化的诸多因素,如:生长因子、氧气浓度、三维支架等。并对间充质干细胞作为种子细胞存在的问题和下一步的发展方向提出了见解。
L-色氨酸作为人体内的一种必需氨基酸,广泛应用于医药、食品与饲料等行业。工业上采用的色氨酸生产方法有化学合成法、转化法及微生物发酵法。近年来,随着代谢工程在色氨酸菌种选育中的成功运用,微生物发酵法逐渐成为主要的色氨酸生产方法。系统综述了微生物发酵法生产色氨酸所涉及的代谢工程策略,包括生物合成色氨酸的代谢调控机制以及途径改造的措施和效果,此外,还探讨了L-色氨酸未来的发展前景。
当前组织工程研究仍处于初级阶段,还仅仅是初步应用组织工程技术修复临床简单组织缺损,还有许多制约组织工程应用与发展的基本科学问题没有阐明。随着组织工程各个层面技术难题的逐个攻破,组织工程的内涵和外延将不断拓展,并有助于加快组织工程的产业化进程,促进临床应用。针对组织工程核心要素研究的不足,结合最新的组织工程研究进展,阐述了现代组织工程发展的趋势与前景。
