目的：摸索搅拌式生物反应器培养小鼠胚胎干细胞（mESC）的最佳条件，建立一种批量制备拟胚体（EB）的方法。方法：研究mESC不同接种密度及生物反应器初始搅拌速度对EB形成的数量和质量的影响，以细菌培养皿中形成的EB为对照，用抗坏血酸诱导其向心肌细胞分化，比较两种培养体系对EB心肌细胞分化潜能的影响，通过免疫荧光染色及RTPCR对ESC来源的心肌细胞进行鉴定。结果：当mESC接种密度为1×105~3×105个/ml，搅拌速度设定为15~30r/min时，搅拌式生物反应器能高效制备出大量相对均一的EB，EB中几乎没有坏死细胞。与细菌培养皿制备的EB相比，生物反应器培养的EB向心肌细胞分化的效率更高，并表达心肌特异性基因。结论：搅拌式生物反应器培养促进EB的形成及其向心肌细胞分化，是一种更为理想的EB培养系统。
目的 构建表达重组人骨形成蛋白7 （bone morphogenic protein 7, BMP7）基因的重组逆转录病毒，观察其对人肝癌细胞HepG2的凋亡诱导活性，并探讨其作用机制。方法 克隆BMP7基因，以loxP同源重组法构成逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP7（pLLBMP7），转染包装细胞PT67进行病毒包装并测定病毒滴度；将逆转录病毒感染人成骨细胞，MTT法检测细胞生长变化，琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡；Western blotting检测BMP7，caspase-3和bcl-2蛋白表达。结果 重组逆转录病毒载体pLLBMP7经鉴定连接正确，转染PT67细胞后上清液中可得到病毒，滴度达1×109pfu；MTT检测见pLLBMP7病毒组48和72h细胞抑制率高于对照组（35.1% vs. 5.3%，68.5% vs.18.3%，均p<0.05），48h可见BMP7蛋白高表达。琼脂糖凝胶电泳出现典型梯形条带；流式细胞仪检测出现凋亡峰，于转染48h后达最高峰，其凋亡百分率高达14.42%；BMP7蛋白高表达时caspase-3蛋白的表达亦有显著升高，但bcl-2蛋白未见表达差异。结论 构建了BMP7逆转录病毒，在体外能够有效地诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡，其可能是通过激活caspase-3而发生作用。
目的：利用原子力显微镜等方法，明确α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）过表达对线粒体的影响。方法：将腺相关病毒（AAV）载体介导表达的α-syn (AAV /α-syn)病毒包装颗粒，给大鼠脑内黑质区定位注射，建立α-syn过表达的大鼠模型，并以AAV介导表达的报告基因LacZ (AAV/LacZ)为动物对照组。提取大鼠黑质脑组织的线粒体，并通过JC1染色检测线粒体膜电势（ΔΨ）变化和Western Blot检测线粒体中α-syn蛋白量的变化；采用原子力显微镜观测线粒体表面结构的变化。结果：实验组大鼠黑质脑组织过表达α-syn基因，第16周时，Western blot显示线粒体中α-syn蛋白量增加约2倍；JC1染色发现ΔΨ下降；原子力显微镜观测可见线粒体体积增大，线粒体膜表面出现较多孔道样改变。结论：大鼠黑质脑组织过表达α-syn基因，第16周时，可导致α-syn蛋白在线粒体积聚；并可引起线粒体增大、膜形成孔道样改变、ΔΨ下降。
目的:以小白鼠为试验模型，检测金黄色葡萄球菌α溶血素基因工程蛋白单位疫苗的抗体效价水平和免疫保护力，初步评价此亚单位疫苗的免疫效力。方法:Bradfrod法对目的蛋白进行蛋白含量测定，Geoffroy法测定目的蛋白半数溶血效价和活性，建立ELISA方法测定抗体效价，并且通过攻毒得出疫苗免疫保护力。结果:纯化的目的蛋白在53kDa处显示单一条带，蛋白含量为0.1278mg/ml；溶血比活为8012.5HU/mg；所有试验小鼠在首免一周后采集的血清中都检测到了特异性抗体，而抗体效价开始时呈逐渐上升趋势，达最高值后随时间延长逐渐降低。结论:纯化的目的蛋白达到电泳级纯度，且依然保持良好的黏附活性，蛋白疫苗作用机体产生的抗体水平符合抗体消长规律。
重组Candida utilis尿酸酶由含PET-Uricase表达质粒的重组E.coli JM109(DE3)经乳糖诱导表达，菌体破碎后依次经过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析可以获得纯度95%的重组尿酸酶。还原性SDS-PAGE和HPLC测得其亚基表观分子量和天然分子量分别约为33 kDa和130 kDa。获得的纯酶与20 kDa (mPEG)2 -Lys-NHS在特定的条件下反应合成PEG-重组酵母尿酸酶结合物,考察了重组酵母尿酸酶PEG化前后的基本性质，结果显示PEG化尿酸酶的最适pH为7.5，较修饰前下降了1个pH单位，酸碱稳定范围与修饰前类似，都在pH 6-10范围内稳定；修饰前后最适温度均为40℃，重组酵母尿酸酶的热稳定性和抗蛋白酶水解能力较PEG修饰前有较大提高；PEG化尿酸酶可保留修饰前酶活力的87.5%；在最适条件下，PEG-尿酸酶结合物的Km为3.57×10-5 mol/L，而修饰前测得的Km为3.91×10-5 mol/L。研究结果为深入探讨PEG化尿酸酶的结构与功能奠定了基础。
为利用基因工程技术获得重组血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)，根据大肠杆菌的密码偏好性，设计并人工合成编码28个氨基酸的VIP基因。克隆到表达载体PTWIN，构建重组质粒PTWIN-VIP，转化宿主菌E. coli Strain ER2566，构建表达工程菌。实现由重组VIP，内含肽与纤维素结合域（cellulose binding domain, CBD）组成的融合蛋白表达。融合蛋白经几丁质亲和层析纯化，通过改变温度和缓冲液PH值切割融合蛋白，获得目的多肽。所得的多肽经质谱测定分子量结果与理论值相符。生物活性分析表明，重组VIP能显著降低急性炎症小鼠血清中抵抗素的水平，发挥抗炎作用。重组VIP的制备及其抗炎活性的鉴定为其深入开发奠定了基础。
Era是细菌生长必须的一高度保守的GTPase。yggG是从大肠杆菌全基因组文库中钓取并克隆的Era结合蛋白基因，进一步的研究表明该基因在大肠杆菌中的表达与环境应激相关，提示yggG基因产物参与细菌的应激调控。为了阐明YggG蛋白与Era蛋白间的相互关系，利用所构建的双启动子表达载体pDH2-YggG-Ptac-Era在同一细胞中同时表达YggG与Era蛋白，并通过免疫共沉淀实验检测细菌裂解产物YggG与Era蛋白间的相互作用；在此基础上，构建并表达纯化了GST融合的Era蛋白氨基端截短肽和Era羧基端截短肽，通过GST Pull-down检测了Era不同功能区域与YggG蛋白间的相互作用。结果显示， Era/YggG 复合物仅存在于同时过表达Era和YggG蛋白的细菌细胞内，不诱导Era或者不诱导YggG蛋白过表达，均检测不到Era/YggG 复合物存在；纯化的GST不能Pull-down YggG蛋白，而纯化的GST融合的Era蛋白、Era氨基端截短肽及Era羧基端截短肽均可以Pull-down YggG蛋白；GST融合Era氨基端截短肽和GST融合的Era蛋白对YggG蛋白结合作用明显高于GST融合的Era蛋白羧基端截短肽。上述结果说明，YggG是一大肠杆菌Era结合蛋白，YggG与Era的氨基端和羧基端的结合活性存在差异。
可待因酮还原酶(COR)与小檗碱桥酶(BBE)是吗啡合成代谢途径的关键酶，其活性大小直接影响着吗啡合成途径中生物碱的代谢合成。采用RT-PCR从罂粟幼叶克隆出COR和BBE基因全序列，同源性比较结果显示，它们与GenBank上已报道的COR和BBE基因高度同源。利用blast及分子生物学软件DNAStar对COR和BBE基因的cDNA序列同源性进行分析比较，分别从各基因中筛选和克隆了一段同源性极低、约400～500 bp的片段；并应用重叠PCR法将其拼接成744 bp的融合基因BC，以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础，构建了以CaMV 35S启动子驱动的含有“正向BC融合片段- pdk内含子-反向BC融合片段”的ihRNAi植物表达载体，通过转化野生罂粟，初步研究了以COR和BBE基因为靶标的RNAi对内源吗啡合成的抑制效果，为进一步培育低吗啡高蒂巴因的罂粟种质提供了依据。
羊草是分布于我国北方地区重要的禾本科牧草，为了保护羊草资源和培育羊草新品种，本文利用基因枪技术进行了CMO和BADH双基因转化羊草的研究。首先，以1301质粒为基础，构建了均由35S启动子驱动的无抗生素选择标记CMO基因和BADH基因的植物双基因表达载体pCAMBIA-1301-CMO-BADH；然后，通过基因枪技术将其导入羊草中，PCR扩增后电泳检测及Southern杂交分析表明，外源基因已整合到受体植物基因组中并正常表达。在高浓度混合盐和高pH值胁迫下，转双基因植株甜菜碱含量高于对照植株。
应用Thermal Shift Assays技术，高通量优化了重组森林脑炎病毒丝氨酸蛋白酶纯化过程中所使用的缓冲液中盐的种类和pH，显著改善了该重组蛋白在纯化过程中出现可溶性聚集体的现象。最终获得的重组蛋白质单体量由原先的75%提高到99%以上，极大提高了该纯化蛋白质的均一性和质量，为后续的蛋白质结晶研究奠定了基础。
目的：建立人IL-6 /sIL-6R 结合的分子模型，用于筛选IL-6 /sIL-6R的抑制剂。方法：将人IL-6基因克隆至原核表达载体pET28a（+）中表达IL-6蛋白，western blot及人IL-6检测试剂盒分析鉴定表达蛋白。同法将人sIL-6R在pET15b载体中表达，纯化并用western blot检测目的蛋白。依据ELISA原理建立IL-6 /sIL-6R 结合的分子模型，并通过改变IL-6、sIL-6R及IL-6 antibody的浓度来优化该模型，用于IL-6 /sIL-6R拮抗药物的筛选。结果：人IL-6可在载体PET28a（+）中高效表达，且经western blot鉴定正确，人IL-6检测试剂盒检测显示具有较高的免疫活性。sIL-6R在PET15b中表达，western blot鉴定正确。通过对IL-6 /sIL-6R结合的分子模型的优化，得到其最佳条件为：IL-6R 1?g/well, IL-6 500ng/well, IL-6 antibody 1?g/well。应用该模型筛选发现有些化合物可显著抑制IL-6与其受体的结合。结论：成功构建IL-6 /sIL-6R结合的分子模型，为高通量筛选IL-6拮抗剂提供平台。
MAST方法采用人工文库的DNA标签序列鉴定mRNA的可接近位点。大量的标签序列通过扩增和克隆测序达到阐明mRNA结合位点图。设计了单一引物的PCR，其引物在标签序列两端结合搭桥，在扩增中DNA标签序列在搭桥引物的作用下进行连接，连接的标签序列再克隆和测序。十几条这样的连接产物包含了上千条标签序列。该PCR方法简单、高效以用于高通量的方式对标签序列测序。
目的：利用口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体建立液相阻断ELISA检测方法，进行定量检测口蹄疫病毒培养液中的非结构蛋白含量。方法：首先将工作浓度的3B单抗与待测病毒培养液过夜结合反应，然后取结合液转移至用3B蛋白包被好的酶标板上，用标准3B蛋白做12个梯度做对照，同时设阴性对照和空白对照。通过回归分析算出口蹄疫病毒培养液中的非结构蛋白3B含量。结果： 回归曲线呈典型的S形，符合4参数logit曲线拟合，相关系数R =0.99，检测范围为5~1500ng/ml，半数抑制浓度(Ic50)为130ng/ml。结论：该方法能特异、敏感的检测到病毒培养液中的非结构蛋白3B成分，并进行定量。
采用柔性Linker(GGGGS)和重叠延伸PCR方法将三个毒素基因, 即副溶血性弧菌的耐热型直接溶血素基因tdh、创伤弧菌的溶细胞毒素基因vvhA和拟态弧菌的热不稳定型溶血素基因vmhA的成熟蛋白基因片段进行串联, 得到三联融合毒素基因tdh-vvhA-vmhA(命名为FT)。一致性比对分析与预计融合的基因序列一致性为99.6%。FT的开放阅读框架全长3225 bp, 编码1074个氨基酸残基, 预测分子量为120.4 kDa。将FT亚克隆至表达载体pET-22b(+)中, 再转化至E. coli BL21 (DE3)中进行表达, 经SDS-PAEG分析, 融合蛋白分子量与预测的相符。终浓度为1mmol/L的IPTG, 37 ℃诱导4 h, 融合毒素蛋白表达量最高, 经薄层扫描分析, 此时融合毒素蛋白占全菌体蛋白的11.49%。融合毒素蛋白包涵体经纯化, 免疫豚鼠制备血清抗体, 确定间接ELISA的最佳工作条件, 并进行敏感性、特异性、重复性及模拟样品检测试验, 建立了食物中毒性弧菌广谱、快速、特异的同步免疫学检测方法。
目的：利用稀土离子作为示踪剂，建立DON/ZEN双标记间接竞争时间分辨荧光免疫分析方法同时检测DON、ZEN。 方法：以DONBSA、ZEN-BSA共包被于固相微孔板，与DON/ZEN标准或样品中的DON、ZEN竞争结合抗DON多抗、抗ZEN单抗，然后分别用稀土离子Eu3+-羊抗兔IgG及Sm3+羊抗鼠IgG进行示踪检测，并对建立DON/ZEN-双标记TRFIA进行方法学的考核。结果：DON/ZEN-双标记TRFIA检测灵敏度，DON为0.2 ng/ml、ZEN为0.7 ng/ml，检测范围为：DON 0.2~100 ng/ml，ZEN 0.7~50 ng/ml，批内、批间变异率均小于10%。不同样品添加回收实验表明玉米、小麦样品中DON平均回收率分别为102.8%、98.8%，ZEN平均回收率分别为94.2%、95.7%。DON/ZEN-双标TRFIA检测时，DON与ZEN不相互干扰，该方法特异性好。玉米样品检测结果表明，DON/ZEN双标记TRFIA与单标记DON-TRFIA、ZEN-TRFIA试剂盒结果高度相关，具有较好的一致性，两者检测DON的结果相关系数为0.9760，检测ZEN结果的相关系数为0.9695，结论：DON/ZEN-双标记TRFIA灵敏度高，检测范围宽，重复性、稳定性好，一次检测可同时得到DON、ZEN两个结果，是一种简便、快速、经济、稳定、可进行大批量样品筛查的检测方法。
联合疫苗含有两种或多种免疫原（活的、灭活的病原体或者提纯的抗原），用于预防多种疾病或由同一病原体的不同亚型或血清型引起的疾病，可以避免常规免疫多次注射的问题。然而和单价疫苗相比，联合疫苗研发的复杂性大大增加，将多种免疫原混合到一起进行免疫时不同免疫原间可能因为物理、化学和免疫学机制而干扰其他免疫原的免疫反应，此外佐剂和防腐剂等非活性成分也可能对联合后的活性成分产生影响，这就对联合疫苗的评价提出了特别的要求。本文对联合疫苗的研究应用现状、临床评价和发展前景等方面做一综述。
循环核酸(circulating nucleic acid, CNA)是指存在于血液(血清或血浆)等体液中的细胞外游离DNA和RNA，与生理和病理状态下的细胞代谢密切相关，循环DNA和RNA水平的检测及其在基因诊断等方面的应用对于恶性肿瘤等疾病的诊断和监测具有十分重要的意义。近期人们在进行循环DNA、RNA分子检测的同时，在循环微小RNA(microRNA, miRNA)方面也做了许多的工作，研究结果使得与肿瘤相关的核酸分子检测这一领域变的更加让人振奋。在血液中检出肿瘤特异性的miRNA并将其作为肿瘤的生物学标志对于早期诊断肿瘤具有至关重要的意义。
弓形虫疫苗是预防弓形虫感染的最有效手段之一。随着生物学研究技术的不断进步，弓形虫疫苗的研究也不断深入完善。本文介绍了近年来发展起来的基因工程疫苗的最新研究现状及进展，以期望在对现有研究成果总结的基础上，为大家以后的研究提供新的视角和方向。
乳酸乳球菌通用表达质粒pMG36e是一个经典的人工构建的组成型表达载体，是以乳酸乳球菌乳脂亚种蛋白酶基因的转录和翻译信号为基础构建而成的。它包含一个强启动子，能够在多种细菌中表达外源蛋白。已用于研究细菌素作用机制，乳酸菌基因工程菌株的改造以及口服疫苗的开发等，应用领域十分广泛，已成为乳酸菌基因工程研究的重要工具质粒之一。本文主要从载体构成、基因表达与食品级载体改造等三方面的应用对其进行综述，旨在为该质粒今后研究提供资料。
随着生物柴油产业的快速发展，大量的生物柴油副产物必将给生态环境及经济发展带来严重影响。如何利用新思路、新工艺、新技术加工处理副产物，将成为制约生物柴油产业发展的主要因素。聚羟基饱和脂肪酸酯（PHA）是当今生物材料领域最为活跃的研究热点，具有广泛的应用前景，但其生产成本高，选择便宜的合成原料一直是从事PHA研究的科学家们考虑的主要问题之一。将生物柴油副产物用于PHA生产研究，有助于解决副产物过度积累和PHA合成原料成本过高的问题，有利于生物柴油产业的稳定、可持续发展。本文综述了近年来生物柴油副产物用于PHA合成的最新进展。
红曲的药用价值和保健功能日益引人关注，然而红曲中桔霉素的存在严重制约着红曲产品的开发，如何降低红曲桔霉素的含量是一个迫切需要解决的问题。本文概述了红曲桔霉素的毒性、生物合成途径及相关标准。并结合国内外研究进展，从发酵工艺，诱变育种，基因工程三个层面阐述了控制红曲桔霉素产生的对策，并对桔霉素今后的研究方向进行了展望。
当今许多国家政府已经把生物医药产业作为新的经济增长点来培育，通过采取不同政策和措施加速生物医药产业的发展。在我国政府相关利好政策的鼓励刺激和资金扶持下，我国生物医药产业有望加快走出经济危机的低谷，迎来快速发展期；在政府的引导下，构建生物产业技术创新战略联盟，推进资源整合和优势互补；多个高科技生物医药产业园区建设蓬勃，形成和集聚了一批具有较强实力的创新型企业，有力地带动了全国生物医药产业的发展和技术创新能力的提高。我国生物医药产业发展的重点要在产学研结合、前沿生物技术方面、市场准入政策和规范市场竞争秩序，以及高素质人才队伍的建设方面有所突破。根据市场导向，国家出台和制定相应的产业发展规划和政策，鼓励生物产业发展，加快国家生物医药产业基地建设；制定有关优惠政策，鼓励生物技术企业多种渠道和形式解产业发展资金问题；建立生物医药产业资源共享的机制，加强沟通与公共平台建设；发挥龙头企业的作用，支持大企业的收购兼并；加强相关法律法规建设，完善生物安全法和知识产权制度等一些措施来应对我国生物产业的快速发展。
