目的：以人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)为诱导因素，研究建立黏蛋白(MUC)5AC和5B高表达的细胞模型，同时对黏蛋白高表达机制进行初步研究。方法：培养人肺腺癌细胞A549，以HNE为刺激因素，EGFR中和抗体、表皮细胞生长因子受体（EGFR）磷酸化阻断剂AG1478为干预因素，分组培养。采用四甲基偶氮唑盐光吸收法（MTT法）检测HNE对细胞活性的影响；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA的变化；酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量分析MUC5AC和MUC5B蛋白含量的差异；细胞免疫化学以及激光共聚焦技术进一步直观观察MUC5AC、MUC5B、p-EGFR蛋白表达的变化。结果：HNE对A549细胞活力的影响呈剂量依赖性；HNE刺激组的MUC5AC、MUC5B基因转录和蛋白表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（均P<0.01）；HNE刺激组p-EGFR蛋白表达显著增多，EGFR中和抗体、AG1478能显著降低HNE诱导的MUC5AC高表达，但对MUC5B高表达无干预作用。结论：人肺腺癌细胞A549同时表达MUC5AC和MUC5B，HNE能有效刺激A549细胞高表达MUC5AC和MUC5B，黏蛋白高表达细胞模型的建立为研究气道粘液高分泌疾病提供了实验基础。HNE通过激活EGFR信号转导通路诱导MUC5AC的高表达，但MUC5B高表达机制与之不同，有待进一步研究。
摘要 目的：构建乳腺癌真核细胞起始因子一4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF-4E)基因重组腺病毒载体，并观察其对乳腺癌细胞MCF-7转移能力的影响。方法：应用基因重组技术将eIF-4E基因构建于腺病毒载体pAD-X，转染293包装细胞得到高滴度重组腺病毒，并用real-time PCR进行eIF-4E基因表达的验证。将重组腺病毒pAD-eIF-4E感染MCF-7细胞后，应用transwell小室法观察其对细胞侵袭和运动能力的影响。结果：酶切结果与预期相符，real-time PCR可检测到转染后MCF-7细胞有eIF-4E基因表达。且病毒转染后transwell小室可见，MCF-7细胞的侵袭和运动能力均受到显著的抑制（均为p<0.01）。结论：重组eIF-4E腺病毒载体正确构建，其对乳腺癌细胞MCF-7的侵袭和运动都有抑制作用。
柞蚕核型多角体病毒（AnpeNPV）作为基因表达载体在柞蚕培养细胞（AnPe细胞）和柞蚕蛹中已经成功地表达出了外来基因，并生产出了大量蛋白质。本文比较了AnpeNPV与苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcMNPV)、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和美国白蛾核型多角体病毒(HycuNPV)基因表达载体在培养细胞和昆虫活体组织内的β-半乳糖苷酶基因表达效果。结果显示，5×105个细胞中β-半乳糖苷酶的最高酶活性分别是AnpeNPV在AnPe细胞为40.9 units/ml （TC-100培养液，FBS10%）和59.9 units/ml（SF-900Ⅱ培养液），AcMNPV在Sf9细胞为72.4 units/ml（TC-100，FBS10%）和66.4 units/ml（SF-900Ⅱ）、在High5细胞为326 units/ml（EX-CELL 405培养液），BmNPV在Bm4细胞为15.1 units/ml（TC-100，FBS10%），HycuNPV在SpIm细胞为68.6 units/ml（SF-900Ⅱ）。活体组织内β-半乳糖苷酶的最高酶活性分别是柞蚕雌蛹为14.3 units/g、雄蛹为11.7 units/g，家蚕幼虫是10.1 units/g。实验证明AnpeNPV/AnPe的外来基因表达水平与AcMNPV/ Sf9和HycuNPV/SpIm相似、比BmNPV/ Bm4高、不及AcMNPV/ High5；AnpeNPV/柞蚕蛹，其雌蛹比BmNPV/家蚕5龄幼虫的外来基因表达效果好、雄蛹与之无明显差异，说明AnpeNPV基因表达载体无论是在培养细胞还是昆虫活体组织中均可与其他NPV基因表达载体相媲美。柞蚕蛹由于可以机械化、大规模地操作，显示对于大量生产蛋白质具有更好的应用前景。
摘 要 利用毕赤酵母系统表达有活性的人单链白细胞介素12（hscIL-12），PCR法从质粒pBI121-IL-12中扩增hscIL-12基因，经酶切、连接构建重组表达载体pPIC9K-hscIL-12，SacI线性化后，PEG1000法转化毕赤酵母GS115，经G418筛选和菌落PCR鉴定，经甲醇诱导，hscIL-12在酵母中获得分泌表达，表达产物经Western Blot检测，显示该蛋白相对分子质量为70KDa，可与鼠抗人IL-12单克隆抗体特异性结合；定量分析结果表明，重组酵母培养上清中hscIL-12约占总蛋白的26％，表达量约为60mg／L；生物学活性实验表明，重组蛋白能促进人外周血淋巴细胞增殖。为利用rhscIL-12进行基因治疗奠定了基础。
高盐等逆境可以加剧植物体内活性氧的产生，进而引起植物细胞死亡。为开发抗逆境作物，以置于氧化诱导型启动子下定位于叶绿体的转铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/ZnSOD）和抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)马铃薯为材料，研究了其对MV和 NaCl所引起的氧化胁迫的耐受性。结果表明， MV胁迫下，转基因马铃薯叶片膜的相对电导率明显低于对照； NaCl胁迫下，其叶绿素含量高于对照。 在含NaCl 的培养基上,转基因幼苗生根率明显大于对照。另外，NaCl胁迫下转基因马铃薯叶片的SOD和APX酶活性显著高于对照，与其耐盐性的提高相一致。这些研究表明，转入Cu/ZnSOD和APX基因的马铃薯清除活性氧的能力增强，抗逆性得到提高。本实验采用氧化诱导型启动子调控下的SOD和APX两个基因协同作用，使外源基因只有在逆境胁迫时才特异性表达，增强转基因植株的抗逆效果，为培育抗逆经济作物开阔了思路。
为进一步探讨抗菌肽CM4的原核表达及其生物学功能，本实验研究了抗菌肽CM4与人可溶性B淋巴细胞刺激因子hsBAFF的融合表达及抗菌肽CM4的生物学活性。运用PCR把B淋巴细胞因子hsBAFF和家蚕抗菌肽CM4进行基因融合，构建了融合表达载体pET28a (+)/CM4-hsBAFF，并在大肠杆菌中获得高可溶性表达的融合靶蛋白，且存在于超声破碎后的上清，经分子筛Sephadex G-75纯化后的重组融合蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定.SDS-PAGE分析表明：可以通过分子筛一步纯化得到融合蛋白，该重组融合蛋白的分子量约22.0 KDa。Western blot结果显示该重组蛋白能与鼠抗人hsBAFF的抗体发生特异性反应.运用基因工程的方法获得CM4-hsBAFF重组融合蛋白，并具有很好的抑菌生物学活性。
利用根癌农杆菌EHA105进行了哈茨木霉Th-33的转化，在优化的转化条件下，EHA105对木霉菌的转化效率约45-100个转化子/106个孢子。本实验室利用该方法已建立了含4000多个转化子的木霉T-DNA插入突变体库。随机挑选24个转化子进行遗传稳定性分析，结果显示转化子经过5代无选择压力连续转接后都能在选择平板上正常生长；潮霉素抗性基因的PCR扩增和Southern blot杂交分析表明，木霉转化子含有该基因，Southern blot杂交进一步表明转化子多为单拷贝随机插入。该转化体系的改进将有利于木霉菌生防功能基因的克隆和作用机制的研究。
本文报道了一种新的检测黄曲霉毒素B1的生物传感器，该传感器以开管的多壁纳米碳管固定化黄曲霉毒素氧化还原酶制作传感电极检测黄曲霉毒素B1，其线性范围达到0.16μM-3.2μM，当把特异性的黄曲霉毒素B1抗体与黄曲霉毒素氧化还原酶通过多壁纳米碳管共固定化制作修饰电极，传感器的检测限提高到16nM，灵敏度提高了10倍。用这种方法制作黄曲霉毒素酶生物传感器，使黄曲霉毒素酶生物传感器向实用化迈进了一步。
根据已报道的单链Monellin甜蛋白的氨基酸序列，按大肠杆菌基因偏爱密码子，设计和人工合成了单链monellin基因。将单链monellin基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中，构建了重组表达载体pET28a-mon，转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达Monellin的大肠杆菌工程菌株。借助SDS-PAGE分析方法，研究了乳糖代替IPTG诱导大肠杆菌表达甜蛋白Monellin。通过对乳糖作为诱导剂表达条件进行优化，Monellin的表达量可占细胞总蛋白的33.09%，与IPTG诱导表达量接近。本研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌生产甜蛋白Monellin提供了参考依据。
目的 评价羟基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)涂层的AZ31B镁合金（HAP/AZ31B）作为植入材料的生物安全性。方法 采用恒电压阴极电沉积法制备表面HAP涂层的HAP/AZ31B材料；判定生物材料的致突变及毒性作用；检测材料表面的腐蚀状况并进行能谱分析。结果 HAP/AZ31B材料无致突变作用，对动物组织未产生严重的炎症反应；经HAP涂层后的AZ31B材料腐蚀较慢，微核出现率为4.4‰，溶血率为0.25%。结论HAP/AZ31B表现出较好的生物安全性和相容性，有可能成为新型可降解骨支架材料。
用废啤酒酵母吸附水溶液中Cu2+，考察了溶液pH值、Cu2+浓度和吸附时间对Cu2+吸附的影响。结果表明：废啤酒酵母吸附Cu2+在4-6个小时内达到吸附平衡，酸性条件利于吸附，以pH为5时最佳，吸附等温曲线符合Langmuir模式。用电位滴定及FTIR分析的方法确定生物吸附剂主要含有磺酸基、羧基及氨基等功能团。生物吸附剂对Cu2+的吸附以单分子层的化学吸附为主，功能团在不同的pH条件下呈现不同的电离性能，在吸附过程中发挥重要作用。
采采用氧化硅超顺磁性纳米磁珠和自己设计的试剂体系及提取流程，建立了一种基因组DNA的快速提取方法，该方法以氧化硅磁珠为固相吸附载体，盐酸胍、 -巯基乙醇和SDS为主要裂解吸附试剂。以全血或培养细胞为实验材料进行基因组DNA的提取结果显示用本文建立的方法提取100 L小鼠抗凝血，可得2～3 g基因组DNA， OD260/OD280为1.8 ± 0.05，其纯度可满足后续的酶切和PCR生物操作要求。该方法整个提取过程只需12分钟，不需特殊实验条件同时可省略蛋白酶K的消化过程和离心操作，适用于一般实验室的需求，是一种操作简便、快速高效的提取方法。
本文优化了提取Rhizobium sp.N613胞外多糖(REPS)的工艺条件，以发酵液pH值、乙醇浓度以及醇沉时间为因子，采用响应面法试验获得了REPS的最佳提取条件，即pH 5.9,乙醇浓度74%，醇沉时间16.5h。在该条件下，胞外多糖提取率为9.28±0.06 g·L -1，其纯度达97%，收率达93.6%。此外，还进行了REPS的特性粘度、急性毒性测试和蓄积毒性实验，结果表明该多糖具有粘度高、无毒性的特点，在食品医药领域有着广泛的应用前景。
氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）能够在胞内形成电子致密的磁性颗粒，它的这种特性使利用氧化亚铁硫杆菌合成生物纳米磁性材料成为了可能。本课题组为了筛选出合成磁性颗粒能力强的菌株，对原有的液体磁泳进行了改进，采用了新的固体平板磁泳方法来筛选纯化目的菌株。经过磁泳分离后，细菌中含磁性颗粒的细胞比例由原始菌群的30％上升到90％，胞内含有的磁颗粒数目也由1~2颗增加至2~5颗，筛选得到的细菌在人工磁场下会进行趋磁运动。实验结果表明，氧化亚铁硫杆菌具有较弱的趋磁性，在人工磁场下会进行趋磁运动，但仅在地磁场作用下不能定向运动，利用固体平板磁泳筛选纯化含有磁性颗粒的氧化亚铁硫杆菌的方法是切实可行的，磁泳分离技术的进一步完善和改进为传统的微生物菌种分离提供了新的途径，为研究纯氧化亚铁硫杆菌菌株胞内磁性颗粒的形成条件及机理提供了前提条件，也为今后从浸矿细菌中分离筛选更多的含有磁性颗粒的菌株打下基础。
构建表达成骨相关转录因子Osx的腺病毒，观察Osx对原代培养的小鼠成骨细胞增殖与分化的调控作用。将Osx编码基因克隆入腺病毒载体pAdEasy中，经293A包装后得到重组腺病毒，感染原代培养的小鼠颅骨细胞，茜素红染色观察矿化程度，实时定量RT-PCR检测成骨相关标志基因的转录水平，流式细胞检测细胞周期的改变。结果发现，①得到的病毒滴度为2×109PFU/ml，最佳感染复数为50；②表达Osx并不能够促进成骨细胞的矿化；③定量RT-PCR表明表达Osx 1d、3d、6d后成骨分化标志骨钙素、骨涎蛋白、Ⅰ型胶原蛋白的表达量明显上调(p<0.01)；④流式细胞仪的结果表明Osx能够促进成骨细胞的增殖(p<0.01)。通过腺病毒在原代培养的成骨细胞中表达Osx能够促进成骨细胞的增殖，并对其分化具有一定的调控作用，为Osx在各种骨损伤的基因治疗应用方面提供了基础。
目的：研究一组新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶（earthworm Desoxyribonucleases, EWDs）的主要生化性质。方法：采用SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF、酶活性测定等方法。结果：确定了EWD1、EWD2、EWD3(总称为：EWDs)的分子量分别为157.2kDa、69.1kDa和63.5kDa；Km值分别为1.58mg/ml、3.95mg/ml、1.52mg/ml。EWDs在55℃时，酶活性完全丧失。这三种脱氧核糖核酸酶最适pH范围在pH4.0～5.6之间。Mn2＋、Ca2＋是蚯蚓组织脱氧核糖核酸酶EWD1、EWD2、EWD3的抑制剂，Mg2＋对EWD3有较明显的抑制作用。结论：蚯蚓中的EWDs分子量明显大于DNaseⅠ和DNaseⅡ。对EWDs的温度、pH值、激动剂、抑制剂等影响因素的研究，发现这些参数与已发现的DNases相比较有明显差别。这些提示：蚯蚓组织中发现的脱氧核糖核酸酶EWDs具有特殊的酶学特征，不同于DNaseⅠ和DNaseⅡ，是种新型的脱氧核糖核酸酶，但其作用机理和分类有待于进一步的研究和归类。
为了提高云芝菌发酵生产漆酶的效率，提出了一种利用自絮凝菌丝球在三相鼓泡塔生物反应器中重复分批发酵产漆酶的新方法。在优化后的产酶条件下，考察维生素C的添加浓度对漆酶活力的影响，并通过在培养基中添加维生素C进行漆酶多批次培养。研究结果表明，维生素C的添加浓度为1.50mmol/L时，可使漆酶活力提高2.6倍。连续进行了10批培养，每批最大漆酶的活力均在1000 U/mL以上，最高酶活出现在第五批为1919.6 U/mL，总培养时间达25 d。此方法所得漆酶对染料靛蓝具有明显的脱色降解作用，在介体1-羟基苯并三唑（HBT）用量0.10%，漆酶用量100 U/L条件下作用40 min时，靛蓝脱色率达到96.7%。该方法采用的三相鼓泡塔生物反应器性能稳定、菌丝球可重复使用，该方法有利于漆酶的高效、规模化生产。
成纤维细胞激活蛋白α（FAPα）是肿瘤相关成纤维细胞特异性表达的一种表面抗原，具有二肽基肽酶和胶原酶活性，在肿瘤的生长、浸润、转移中发挥重要作用。故以FAPα作为肿瘤基质标志物的病理诊断、肿瘤基因治疗或免疫治疗将成为可能。本文就近年来对FAPα结构特点、活性作用及在肿瘤诊治中的研究进展进行综述。
降血压肽具有很好的降血压效果而且天然无毒副作用，是目前基因工程研究的热点之一。本文阐述了降血压肽基因工程菌构建的重要性，综述了国内外关于降血压肽及各种小肽表达方面的研究进展。探讨了降血压肽基因工程菌在构建过程中目的片段的选择、串联连接的方式、串联体的获得及表达载体的选择等方面采用的策略和依据,重点介绍了各种不同表达类型载体的优缺点。旨在能对今后做降血压基因工程菌的多肽表达提供参考，以方便实验设计。
在植物基因工程中，需要用到选择标记基因以便筛选转化子。随着转基因植物的商品化，人们越来越关注其安全性问题，其中主要涉及选择标记的安全性。为了提高转基因植物的安全性，生物学家们开始寻找生物安全的选择标记。本文分别从糖代谢、氨基酸代谢、激素代谢、核苷酸代谢、蛋白质代谢等方面综述了当前以代谢关键酶基因作为转基因植物选择标记的研究进展，此类选择标记为解决转基因植物的安全性问题提供了一条有效途径。
摘要 来源于超嗜热菌的超嗜热羧酸酯酶，结构上与激素敏感性脂肪酶(HSL)家族近似，属于α/β-水解酶，但是其空间结构比HSL更加紧密而有韧性，具有很强的热稳定性。性质研究表明，温度和有机溶剂对超嗜热羧酸酯酶的活性和对映选择性影响显著；其最适底物一般是对硝基苯酯，部分酯酶的基因含有GGGX基序，能够水解叔醇酯结构。由于超嗜热羧酸酯酶的独特结构和性质，其应用潜力巨大，尤其在拆分手性的外消旋酯方面独具优势。
