2006年, 第26卷, 第12期　
刊出日期：2006-12-25

  

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研究报告
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  集成干扰素突变体Ⅱ的分子构建、表达及提纯

  牛晓霞,刘金毅,杨轶,吴晓东

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 1-5.

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  目的：通过定点突变，构建集成干扰素突变体Ⅱ（IFN-Con-m2），以期获得兼具高效作用和可定点聚乙二醇（PEG）修饰的新型药物分子。 方法：采用PCR体外定点突变技术，使集成干扰素突变体Ⅰ（IFN-Con-m1）基因的第86位密码子由TAC突变为TGC。将扩增片段克隆入pET-23b表达载体，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。IPTG诱导后，表达的IFN-Con-m2经包含体变复性、疏水层析、DEAE层析和凝胶过滤层析等纯化后，用WISH-VSV系统进行生物活性测定。 结果：IFN-Con-m2以包涵体形式表达，表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后，IFN-Con-m2的纯度大于95%，比活性大于5.0×108IU/mg。 结论：构建了IFN-Con-m2的表达载体，并成功地在大肠杆菌中表达，获得了高活性突变分子IFN-Con-m2，建立了IFN-Con-m2的纯化工艺。
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  人IFN-β启动子基因报告质粒的构建及SARS-CoV3a和7a蛋白对IFN-β诱生作用的初步研究

  徐春娥,付玲,侯丽华,翁少洁,来大志,李健民,于婷,于长明,陈薇

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 6-10.

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  3a蛋白和7a蛋白是SARS-CoV的非结构蛋白，分别主要由SARS基因组中ORF 3a 和ORF 7a所编码。在体内和体外感染病毒的细胞中均发现了有3a蛋白的表达。首先将pGL3-Control载体进行了改构，除去了SV40启动子基因，获得了pGL3-Enhancer载体，将获得的IFN-β启动子基因连入载体中，构建了带有人IFN-β启动子基因的荧光素酶报告质粒IP-21，并且通过实验证明所构建的质粒在干扰素的诱导剂NDV的作用下能够表达荧光素酶活性，照度计检测荧光素酶活性增强，从而验证了所构建的重组质粒的有效性。为了观察SARS-CoV非结构蛋白3a和7a对干扰素诱生途径的影响，将IP-21瞬转入稳定表达有3a和7a蛋白的CHO细胞，通过荧光素酶的信号强弱对3a和7a的作用进行分析，结果表明SARS-CoV的3a和7a蛋白能够刺激荧光素酶的表达，即在体外的细胞实验中，3a和7a能有效地激活IFN-β的启动子部分。此结果对进一步研究3a和7a的功能以及对SARS-CoV的致病机制的进一步研究有一定意义。
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  重组人血清白蛋白在汉逊酵母中的表达与纯化

  孟凡红,金贞姬,张娟,陈尔佳,杨喆,刘勇,包永明

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 11-17.

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  优化人血清白蛋白（Human Serum Albumin, HSA）基因的密码子，合成基因连接到用于汉逊酵母（Hansenula polymorpha）表达的表达载体上，构建成重组人血清白蛋白（recombinant Human Serum Albumin, rHSA）表达质粒，转化汉逊酵母细胞，筛选得到的rHSA高表达细胞株HP-rHSA－C，30L发酵罐批式发酵表达量可达1.033g/L，经Streamline SP，Phenyl Bio-Sep 6FF，DEAE Sepharose层析分离获得纯化蛋白，除菌过滤后稀释，进行小鼠免疫原性分析，结果与人血清中提取的人白蛋白具有相同的抗原、抗体反应特性。
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  人PPARαLBD在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

  李苌清,袁野,杨贵忠,章涛,周歧新

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 18-21.

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  过氧化物酶体增殖物活化受体α(peroxisome prolifterator-activated receptor α，PPARα)属于Ⅱ型核受体，通过其配体结合区（1igand binding domain,LBD）结合特定的激动剂对参与机体代谢的关键酶、受体等的表达起调节作用。本研究从人肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出PPARαLBD的cDNA，将其克隆入表达载体pMAL-p2X麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein,MBP）编码基因malE序列的下游，重组质粒转化E coli TB1，进行了高效的可溶性融合蛋白表达。产物经多糖亲和树脂（Amylose-resin）纯化后，获得了电泳纯的MBP-PPARαLBD。MBP-PPARαLBD用Xa因子酶切，经Amylose-resin亲和层析、DE-52阴离子交换层析纯化回收，获得了电泳纯的PPARαLBD。本研究为进一步比较MBP-PPARαLBD和PPARαLBD的功能，筛选PPARα配体奠定了基础。
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  新型真核表达质粒pcDNA6/myc-his-EGFP B 的构建及其在重组基因表达中的应用

  李新建,曹以诚,杜正平,杨化强,张珍武,卓敏

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 22-28.

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  增强型绿色荧光蛋白（EGFP, enhanced green fluorescent protein）、myc抗原和6×His已在众多真核表达载体中用作重组蛋白的表达标记，EGFP能发出的绿色荧光，myc抗原能用相应的抗体检测，6×His能被相应的树脂特异吸附。但目前为止，没有一个质粒表达载体能够同时整合三者的功能。本研究构建了一个能够同时整合EGFP、myc抗原和6×His功能的新型真核质粒表达载体，我们将其命名为pcDNA6/myc-his-EGFP B。值得注意的是，为确保目的基因与EGFP基因融合表达后，融合表达产物各组成部分能够保持原有的生物活性，我们运用LINKER程序在EGFP基因的5'端设计了一段编码八肽的连接DNA序列。将一段含有人白细胞介素2（IL-2, human interleukin 2）信号肽编码序列的基因亚克隆进pcDNA6/myc-his-EGFP B的多克隆位点中，使之与EGFP、myc抗原和6×His融合表达，构建成质粒pMHES。用pcDNA6/myc-his-EGFP B和pMHES转染2.2.15细胞，48 h后成功观察到绿色荧光；用pcDNA6/myc-his-EGFP B尾静脉注射Balb/c小鼠，8 h后在小鼠肝脏冰冻切片中同样观察到绿色荧光。用同源建模软件Modeller8V2模拟IL-2与EGFP、myc抗原和6×His融合表达产物的三维结构，结果表明：IL-2、EGFP、myc和6×His各部分互不干扰，连接八肽具有一定的柔性。以上结果表明pcDNA6/myc-his-EGFP B可望作为外源基因在哺乳动物细胞中表达研究和基因治疗的新型载体。
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  中性粒细胞蛋白酶抑制剂elafin毕赤酵母表达系统的建立及活性检测

  王晓龙,周向东

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 29-33.

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  中性粒细胞蛋白酶抑制剂elafin是中性粒细胞弹性蛋白酶特异性抑制剂。为建立中性粒细胞蛋白酶抑制剂elafin毕赤酵母表达系统，通过逆转录PCR扩增获取elafin cDNA,双酶切后定向克隆至穿梭质粒pPIC9K上。SalI酶切线性化后，电穿孔法转至毕赤酵母GS115菌株中，PCR筛选出阳性克隆，接种至最小甘油缓冲培养基中，甲醇诱导表达后，取上清阳离子交换层析纯化靶标蛋白。分别以western-blot、弹力纤维蛋白-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组elafin免疫原性、抗蛋白酶活性。重组elafin在毕赤酵母系统中呈分泌性表达，产量及活性高，分离纯化简便。此表达系统的建立为其后续研究及临床应用奠定了基础。
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  重组HSA-hG-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的表达

  王昌梅,王同映,杨志愉,单剑峰,刘晓妮,马国昌,戎亚雯,方井晋,黄岩山,周金宝

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 34-39.

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  为了延长G-CSF半衰期，我们利用甲醇酵母表达重组人血清白蛋白融合的集落细胞刺激因子（rHSA-G-CSF）。用PCR方法从人胎肝cDNA文库扩增出HSA cDNA序列，hG-CSFcDNA序列从大肠表达载体中酶切获取。将HSA和hG-CSF两片段连接后，克隆到酵母分泌型表达载体pGENYK中，酶切线性化后原生质体转化导入酵母细胞进行整合。工程菌经发酵灌培养表达，层析法分离纯化融合蛋白。纯化的融合蛋白经Western 印迹分析表明具有HSA和G-CSF的免役原性，体外生物学活性分析表明，同縻尔数的融合表达产物的活性为E.coli表达G-CSF单体的活性的50%以上。体内动物实验研究表明，经HSA融合的G-CSF的半衰期为G-CSF单体的15-20倍。甲醇酵母表达的融合HSA的G-CSF具有比G-CSF更长的半衰期，有良好的临床应用前景。
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  HPV16+治疗性无佐剂蛋白疫苗—HPV16Z- Hsp65-E6/E7的构建、表达及纯化工艺研究

  王小兵,李茉,刘毅,田海梅,刘朝阳,李艳芬,曹冬艳,粱智,程冬婉,邵长君,张伟

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 40-44.

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  目的：研制针对我国宫颈癌高危相关的HPV16型的治疗性无佐剂蛋白疫苗。方法：应用PCR技术自我国山西宫颈癌高发现场分离到的毒株-HPV16z中获得E6/E7转化基因片段，自卡介苗菌株中克隆获得Hsp65基因片段，对E6/E7基因片段定点突变修饰，构建pET28a-Hsp65-E6/E7表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白，并研究重组蛋白的纯化方案和工艺。结果：成功构建pET28a-Hsp65-E6/E7重组表达载体，E6/E7突变位点正确，融合蛋白在亲和层析柱上正确复性和初步纯化，经阴离子交换色谱纯化后蛋白纯度达到95%。结论：该研究为无佐剂治疗性重组蛋白疫苗Hsp65-E6/E7的进一步功能研究奠定了基础。
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  海蚕新型抗菌肽Perinerin在毕赤酵母中的表达及活性测定

  周庆峰,罗学刚,叶亮,申静,丁艳,段玥,奚涛

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 45-49.

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  摘要：利用巴斯德毕赤酵母表达系统，对海蚕抗菌肽 Perinerin 进行分泌性表达，并进行活性检测。首先通过 SOE 法（Gene splicing by over lap extension）设计三对互补引物来合成完整的Perinerin 的基因,将该基因片断插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列载体pPICZαA中,构建了重组表达质粒 pPICZαA-PEN ,转化Pichia pastoris GS115 宿主菌,利用甲醇来诱导外源基因在阳性菌株中的表达,表达产物经 Tricine-SDS-PAGE 电泳验证。生物学活性检测证实重组蛋白对部分革兰阳性及革兰阴性细菌有明显抑制作用,尤其对绿脓杆菌有强烈的抑制作用。
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  珍稀濒危树种毛红椿微卫星DNA分离及SSR反应体系优化

  刘军,孙宗修,陈益泰,何贵平,吴天林

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 50-55.

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  本研究以江西宜丰种源毛红椿为材料，成功提取其基因组DNA。利用改良的链亲和素磁珠法亲和捕捉出毛红椿基因组微卫星DNA片断，并构建了富含微卫星的基因组文库。从构建的基因组文库中随机挑选了63个单克隆进行测序，其中50个单克隆成功测序，含有微卫星的单克隆有18个，并根据测序结果设计并合成SSR引物18对。利用所合成的引物优化SSR反应体系，对影响SSR反应的各个因子进行了探讨。确定了模板DNA浓度最适浓度为30ng；dNTP的最适浓度为0.3mmol·L-1；0.3μmol·L-1是引物在反应体系中的最合适浓度。建立了重复性好、稳定性好的SSR反应体系，为下一步进行毛红椿群体遗传结构和遗传变异研究提供了技术支持。
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  川草2号老芒麦（Elymus sibiricus L.）UV-B辐射敏感基因rbcL的克隆及其调控表达研究

  何文兴,李洪梅,徐莺,肖猛,李群,颜钫,王胜华,陈放

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 56-62.

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  rbcL是编码光合关键酶1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）大亚基的基因。本文运用mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）并通过5ˊRACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 从高原植物川草2号老芒麦（Elymus sibiricus L. cv. 'chuancao No.2'）中获得了受增强UV-B辐射抑制的rbcL基因，该基因全长cDNA为1.51kb，开放阅读框（ORF）长1.434kb，编码477个氨基酸。氨基酸序列与Elymus trachycaulus中的Rubisco大亚基具有97％的同源性、与Triticum aestivum和Hordeum comosum的Rubisco大亚基同源性均为 98％。Northern杂交分析表明，增强UV-B辐射后6h，rbcL基因表达受到强烈抑制，处理后60h，其表达几乎完全被抑制，表明即使是长期生长在高原地区、强UV-B辐射条件下的高原物种，在受到较强的UV-B辐射后，其rbcL基因的转录也会受到抑制。
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  猪细小病毒核酸疫苗的构建及其对小鼠免疫原性的研究

  魏战勇,王学斌,崔保安,黄克和,金喜新,王亚宾,陈红英

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 63-67.

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  将猪细小病毒VP2基因克隆至pCI-neo真核表达载体中，构建了pCIneo-VP2重组质粒，转染至PK-15细胞中，利用免疫荧光方法检测在体外表达情况；并以小鼠为动物模型，将pCIneo-VP2、pCI-neo重组质粒、猪细小病毒活疫苗和对照组通过肌肉注射进行免疫，检测免疫小鼠的淋巴细胞转化功能，特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果显示，pCIneo-VP2在体外能够诱导PK-15细胞表达VP2蛋白，小鼠注射pCIneo-VP2质粒 1周后能够诱导机体产生抗体，4周时达到峰值，与活疫苗对照组产生的抗体滴度、诱导T淋巴细胞增殖和诱导强的细胞毒性基本一致。试验表明，构建的pCIneo-VP2能够有效诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，为研制出高效、新型猪细小病毒疫苗提供了科学依据和试验依据。
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  法夫酵母高产虾青素的选育及发酵条件的优化

  谢虹,周元元,胡卫成,梁建生

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 68-74.

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  对法夫酵母原始菌株进行了紫外线－氯化锂复合诱变，获得了一株遗传性状稳定、在25℃条件下虾青素高产的菌株UL-40。其类胡萝卜素产量为7.10mg/L，经HPLC测定，其虾青素产量为643.97μg/g，比出发菌株提高了249.87%。利用SAS软件中的Plackett-Burman设计对发酵温度、初始pH值以及发酵培养基的八种组分进行优化组合，从中选出发酵温度、初始pH值和Corn steep liquor浓度为重要因素，通过响应面分析法建立了模型并从该模型中计算出在发酵温度为16.78℃、初始pH为4.73和CSL浓度为7.06mg/L时预测的最大响应值为3.9407mg/L，经实验证实此点的实测值为3.9261mg/L，证明模型是有效的并且存在极大值点。采用优化后的发酵条件及发酵培养基，法夫酵母生产虾青素的产量较原始发酵培养基提高了20.4%。
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  在Klebsiella pneumoniae醛脱氢酶失活菌中构建NADH再生系统

  黄志华,张延平,黄兴,王宝光,曹竹安

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 75-80.

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  生物法生产1,3-丙二醇（1,3-Propanediol，1,3-PD）是当前工业生物技术研究的热点之一，生产过程中，需要消耗还原当量NADH，NADH的有效供给决定了1,3-PD的产量和得率。本文采用PCR的方法从Candida boidinii基因组中克隆编码fdh的基因，将该基因片段插入载体pMALTM-p2X，构建表达载体pMALTM -p2X-fdh，并转入醛脱氢酶失活菌Klebsiella pneumoniae DA-1HB，获得重组菌Klebsiella pneumoniae DAF-1。在IPTG浓度0.5 mmol/L时，诱导3 h后甲酸脱氢酶表达明显；发酵过程中甲酸脱氢酶比酶活达到4.82 U/mg；与出发菌株K. pneumoniae DA-1HB相比，重组菌DAF-1合成1,3-丙二醇的浓度提高了19.2%?。
技术与方法
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  结直肠癌血清肿瘤标记物液相芯片制备条件的优化及在CEA抗原检测中的初步应用

  张华宁,高雪芹,韩金祥,黄海南

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 81-85.

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  液相芯片技术由于其高通量，灵敏度高，信噪比高，液相条件下反应，操作简便，耗时短等优点，已被美国FDA批准成为临床的检测手段。本文主要介绍了结直肠癌血清肿瘤标记物液相芯片制备条件的优化及其在CEA抗原检测中的初步应用。本研究首先将CEA抗原的捕获抗体与微球载体进行偶联，制备液相芯片，然后对影响反应的微球与抗原的反应时间，生物素化检测抗体的浓度及avidin-PE荧光染料的反应浓度等因素进行正交设计，确定出最优的反应条件；用该液相芯片反应体系检测55例临床样本，与ELISA试剂盒检测结果相比：在同样的样本浓度范围内，两者的检测结果基本一致，但液相芯片检测的浓度范围更大而且液相芯片可将多种肿瘤标记物在一个反应进行检测，节省检测的时间和人力。
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  BMSCs在PLGA-[ASP-PEG]基质材料表面粘附及增殖的研究

  段智霞,郑启新,郭晓东

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 86-91.

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  目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs在聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇三嵌段多元共聚物 PLGA-[ASP-PEG]表面粘附、增殖的情况，为组织工程学体外诱导种子细胞生长提供新的生物材料。方法：在PLGA支架材料中引入聚乙二醇（PEG）和含有多个功能位点的天冬氨酸（ASP），制成PLGA-[ASP-PEG]高分子支架材料。 将PLGA-[ASP-PEG]支架材料与BMSCs复合培养，以未改性的PLGA支架材料作对照，通过沉淀法、MTT法和考马斯亮蓝法分别检测BMSCs的粘附和增殖变化；扫描电镜观察黏附细胞的形态。结果 BMSCs在PLGA-[ASP-PEG]材料表面帖壁生长，细胞数目明显多于单纯PLGA组。细胞粘附率检测显示：改性后的PLGA-[ASP-PEG]表面BMSCs的粘附性能和增殖能力明显高于对照组，P＜0.05。MTT比色试验，BMSCs在三嵌段材料上培养20d后，吸光值A=1.336，约为对照组0.780的两倍。细胞内蛋白总量间接反映细胞黏附及增殖情况。培养12d时，在PLGA-[ASP-PEG]材料组细胞的蛋白含量为66.44μg/孔，单纯PLGA组为41.23μg/孔，间接说明了三嵌段材料生物相容性好，细胞黏附力强的特点。结论PLGA-[ASP-PEG]能促进组织工程种子细胞在骨基质材料表面的黏附、增殖并能较好地保持细胞的形态。
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  水稻稻瘟菌抗性相关蛋白的双向电泳分析

  谢娟,黄明星,卢代华,王胜华,陈放

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 92-98.

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  建立抗感水稻品种受稻瘟菌侵染和未侵染蛋白质的双向凝胶电泳图谱，分析其差异表达的蛋白，寻找稻瘟病的抗性相关蛋白，以阐明稻瘟病的发病机制。采用TCA/丙酮沉淀法提取四种愈伤组织材料的总蛋白并采用固相pH梯度( immobilized pH gradient, IPG)双向凝胶电泳( two-dimensional gel electrophshiya, oresis, 2-DE)分离四种材料总蛋白质, 凝胶经银染显色后，用PDQuest图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质。成功获得抗感水稻品种受稻瘟菌侵染和未侵染蛋白质的双向凝胶电泳图谱。获得未侵染内香优2号平均蛋白点数为447个，汕优63平均蛋白点数为440个；侵染后抗性品种内香优2号平均蛋白数为523个，感性品种汕优63平均蛋白质点数为326个。内香优2号未经侵染和侵染后图谱匹配率达 89%和 87%，汕优63未经侵染和侵染后图谱匹配率达86％和85％。内香优2号的差异表达蛋白点数为76个，汕优63的差异表达蛋白点数为114个。两者间存在一些差异表达的蛋白质，为阐明稻瘟病的发病机制打下了坚实的基础。
综述
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  生物可降解材料构建组织工程软骨的研究进展

  刘夏君,彭程,肖涛

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 99-106.

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  关节软骨修复困难，目前临床上治疗关节软骨损伤难以达到满意的效果。组织工程学的兴起为其提供了新的选择。本文介绍了组织工程软骨的发展历史，重点叙述了各种天然支架材料、人工合成材料、复合材料及纳米材料在软骨组织工程中的应用及其优势。目前应用的天然材料存在力学强度差及免疫源性的不足;人工合成材料降解速率快，降解产物具有细胞毒性，有待进一步完善。表面修饰等技术的应用在一定程度上克服了某些材料的不足；复合材料综合了数种材料的优点，是今后材料技术发展的方向；纳米技术的出现使新合成的材料成为纳米量级，具有了普通材料无可比拟的优势，这为组织工程材料的发展提供了新的思路。本文还对组织工程支架材料存在的问题、下一步的发展方向和前瞻性研究做了介绍。
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  透明颤菌血红蛋白的应用进展

  袁宁,胡又佳,朱春宝

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 107-111.

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  透明颤菌血红蛋白（VHb）具有在限氧条件下促进异源宿主细胞生长和增加产物产量的作用，已在发酵、环保、转基因动植物、重组蛋白表达等方面得到了广泛应用。将VHb与酶或蛋白融合表达可提高酶的活性、稳定性或蛋白的分离效率。对VHb进行改造有助于获得性能更良好的"新"蛋白。
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  稻瘟病菌无毒基因研究进展

  石军,龙美西,曲广林,李仕贵,马炳田

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 112-116.

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  水稻与稻瘟病菌之间的特异互作符合基因对基因假说。本文将从稻瘟病菌与水稻抗病基因间的互作特点、稻瘟病菌的分子标记、已克隆的稻瘟病菌无毒基因三个方面对稻瘟病菌无毒基因研究进展作简要介绍
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  转基因林木潜在生态风险研究进展

  侯英杰,张冰玉,苏晓华

  中国生物工程杂志. 2006, 26(12): 117-121.

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  近20年来，转基因技术在林木上的应用已使林木遗传育种研究取得了可喜的成绩，部分转基因林木已经进行了田间试验，还有一些获得了商品化许可。但与此同时，转基因林木的生态安全问题也逐渐引起了人们的关注，这些问题主要体现在外源基因的水平转移，垂直流动以及对昆虫、土壤生态系统、病毒等的潜在影响上。本文简要介绍了转基因林木田间试验、商品化生产情况及其潜在的生态风险，并对转基因林木的进一步发展进行了展望。