2006年, 第26卷, 第10期　
刊出日期：2006-10-25

  

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研究报告
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  50L规模中试发酵重组核苷二磷酸激酶A工程菌

  熊盛,钱垂文,黄立,刘秋英,张美英,王一飞

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 1-6.

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  中试规模发酵重组人核苷二磷酸激酶A（rhNDPK-A）工程菌，并对表达产物进行纯化。摇瓶培养一级种子至合适密度，以10%比例接种二级种子培养基，在7L发酵罐中培养至OD600为9.6～10.5，然后转入80L发酵罐中进行补料分批培养，所得菌体裂解后，经离子交换层析和亲和层析两步纯化得重组蛋白制品。结果表明，50L培养液经过10h培养后，湿菌收量为1560 g/批，NDPK-A表达量为23.8%。另外，补料方式对发酵密度有明显影响。与单纯补加碳源相比，同时补加碳源和氮源可以显著提高菌体产量，但对目的蛋白表达量地提高不明显。在较优条件下，菌体产量为(2220.00±169.71) g/批，蛋白表达量为(22.00±0.42) %，纯化后重组蛋白得率为510mg/L。产物可溶、密度适中、工艺简便的中试发酵条件的建立为高得率、大规模制备重组rhNDPK-A奠定了基础。
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  大豆β-伴大豆球蛋白基因启动子的克隆及功能分析

  易新萍,喻德跃

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 7-12.

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  通过PCR技术从三个栽培大豆（南农99-10、N2899和南农88－1）和两个野生大豆（江浦野生豆－1和ZYD4174）的基因组中分离到大豆7S蛋白α亚基基因启动子片段(7SαP),序列分析表明：7SαP片段包含多个种子特异性启动子所特有的序列元件，如RY重复序列、ACGT、AGCCCCA等,而这五个大豆材料的7SαP序列的同源性达99%。将从南农99-10中克隆的启动子片段与pBI121-GFP连接构建表达载体,经农杆菌介导转化拟南芥。Southern结果显示, 7SαP 片段和报告基因GFP以单拷贝的形式整合到拟南芥基因组中,且GFP在7SαP驱动下获得了种子特异性表达。
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  霍乱弧菌CTB基因的克隆、表达及重组蛋白活性分析

  张国广,曾雅明,李东霄,张红心,陈亮

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 13-17.

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  霍乱弧菌CTB蛋白具有免疫佐剂活性。本研究根据已发表CTB基因的序列设计一对引物，从一株霍乱弧菌中扩增出CTB基因，测序后发现该基因全长375 bp，与国内分离的六株CTB基因的同源性达96.0%～99.2%。将该基因与pTWIN1连接构建了原核表达载体pTWIN1-CTB，重组表达载体转化BL21（DE3）表达菌株，0.8 mmol/L IPTG诱导4 h后，收获的细菌总蛋白SDS-PAGE电泳显示CTB在原核表达系统中得到表达，融合蛋白大小与理论值符合，蛋白产量占细菌总蛋白的20%左右，主要以包涵体形式存在，western杂交和GM1-ELISA结果表明重组蛋白具有免疫原性和粘膜佐剂活性。
技术与方法
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  一种亨廷顿舞蹈症体外药物筛选细胞模型的建立

  王爱娥,张睢扬,于新荣,王东霞,王英,马建新,梅开城,闫春莲

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 18-23.

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  为建立以多聚谷氨酰胺（polyQ）为靶点的亨廷顿舞蹈症体外药物筛选细胞模型，以随机引物PCR法克隆了不同长度的 CAG片段，经序列测定正确后，分别融合到已经建立的氯霉素抗性融合蛋白表达系统pCAR中CAT的N端，重组质粒转化大肠杆菌，并在其中诱导表达，SDS-PAGE 和氯霉素抗性平板试验对目的蛋白可溶性与氯霉素活性进行测定。结果显示长度在40以上的polyQ为不溶性包涵体表达，表现为低水平的氯霉素抗性，40以下的polyQ则以可溶形式表达，表现为高水平氯霉素抗性，从而建立起能够模拟亨廷顿舞蹈症病理过程的体外细胞模型。通过检测模型细胞的氯霉素抗性，可以定性、定量地反映polyQ在体内的折叠状态和可溶性，故可以借助该模型对促溶药物或生物活性物质进行高通量筛选，为亨廷顿舞蹈症预防、诊断、治疗提供了新思路。
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  利用GFP表达系统检测雌激素类化合物的研究

  雷卫祺,马海蓉,孙怡,曹旭

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 24-29.

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  根据雌激素类化合物的转录调节原理，构建受雌激素应答元件（ERE）调控的3×ERE EGFP-N1重组报告基因载体，转染雌激素受体阳性的MCF-7乳腺癌细胞，分离出稳定转染的细胞克隆ERE-GFP-MCF7，将不同浓度的雌二醇（E2）及其他化合物加入稳定转染的细胞后检测GFP表达水平的变化。雌二醇（E2）以剂量依赖的方式诱导稳定转染细胞ERE-GFP-MCF7表达GFP，最大效应浓度为1×10－10mol/L ,EC50为1.5×10－11 mol/L；已知的植物雌激素大豆甙元和白藜芦醇同样以剂量依赖的方式诱导GFP的表达，EC50分别为2.4×10－7 mol/L和6.2×10－6 mol/L，而葡萄籽多酚没有明显的雌激素样活性。雌激素拮抗剂他莫西芬以剂量依赖的方式抑制雌二醇诱导GFP的表达，最大抑制浓度为1×10－7 mol/L。利用此细胞模型检测不同化合物诱导的GFP表达强度可快速检测雌激素受体的配体。
研究简报
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  传染性法氏囊病病毒非结构蛋白VP5的原核表达及多克隆抗体的制备

  张宁,高宏雷,高玉龙,李俊山,冉多良,王笑梅

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 30-34.

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  利用PCR技术,从传染性法氏囊病病毒（IBDV）Gx，Gt毒株中分别扩增出VP5基因,将其克隆到表达载体pET30a、pET28a中。经PCR、酶切和序列分析鉴定获得重组质粒命名为pET28a-GtVP5、pET30a-GxVP5。将pET30a-GxVP5、pET28a-GtVP5分别转化宿主菌BL21(DE3)，在IPTG诱导下均成功表达约24 kDa的Gx-VP5及23kDa的Gt-VP5融合蛋白，并都以包涵体形式存在。将Gx-VP5纯化后的蛋白免疫8周龄BALB/c雌鼠，ELISA分析表明制备的抗血清效价在1:25600以上，Western blot分析VP5表达产物能与抗6×His mAb及抗IBDV多克隆抗血清发生反应，具有良好的免疫反应特异性。
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  插入单个loxP位点的伪狂犬病病毒上海株TK基因缺失株的构建

  王敏秀,苏鑫铭,于春梅,曹瑞兵,陈溥言

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 35-39.

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  根据GenBank已发表的pEGFP－C1序列，设计并合成两对引物，PCR扩增出两端各含一loxP位点的GFP表达盒GFP-loxP。克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-GFP-loxP。基于同源重组原理, pSKLR-GFP-loxP与 PRV SH株基因组DNA共转染293T细胞，在BrdU 的筛选压力下，利用蚀斑法在TK-143细胞上筛选出表达GFP的TK基因缺失的重组毒株rPRV1。将表达Cre酶的质粒载体pPOG231与rPRV1基因组DNA共转染293T细胞，在Cre酶的作用下去除GFP表达盒以及一个loxP位点，筛选得到含单个loxP位点的重组病毒株rPRV2。PCR 扩增证实所获得的重组病毒TK缺失270bp，只有一个34bp的loxP位点，并且能在RK-13细胞上稳定传代。LD50试验表明rPrV2的毒力下降。
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  Saponin对不同趋化因子受体的活化的影响研究

  张瑾,胡琼莹,陈力

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 40-43.

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  本文通过在稳定表达趋化因子受体的细胞系CHO/CXCR1、CHO/CXCR2、CHO/CXCR3、CHO/CXCR4和CHO/CCR5上进行[35S]GTPγS结合实验，研究了Saponin 对不同趋化因子受体活化的影响。实验结果表明：① 对于CHO/CXCR1和CHO/CXCR4， 在反应体系中添加10 μg/ml Saponin能提高受体G蛋白与[35S]GTPγS的特异性结合，使刺激比率(CPMAgonist/CPMBasal)分别从125%和184%扩大到481%和415%；② 对于CHO/CCR5，10 μg/ml Saponin对受体G蛋白与[35S]GTPγS的特异性结合无影响，刺激比率大小未变；③ 对于CHO/CXCR2和CHO/CXCR3，10 μg/ml Saponin降低了受体G蛋白与[35S]GTPγS的特异性结合，使刺激比率分别从171%和168%减小到130%和114%。实验结果表明Saponin是与受体发生作用，对于不同的趋化因子受体，Saponin对受体的活化的影响不同。
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  寡核苷酸阵列比较基因组杂交技术及其应用

  彭翼飞,马文丽

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 44-49.

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  阵列-比较基因组杂交技术（array comparative genomic hybridization, array CGH）能在全基因组水平和/或高分辨率基础上检测染色体拷贝数的变化，主要应用于遗传学和肿瘤学研究。Array CGH中微阵列探针通常是PCR扩增的BAC克隆或cDNA分子。最近几年，寡核苷酸阵列比较基因组杂交（oligonucleotide array CGH, oaCGH）逐渐开始应用。oaCGH与BAC array CGH比较，具有操作更简便、探针设计更灵活、分辨率更高等多项优点，预计oaCGH将逐步取代利用BAC克隆片段或cDNA分子的array CGH。oaCGH的应用及其与其它高通量检测技术的结合将促进新的癌症相关基因、肿瘤耐药基因的发现。本文综述了现有主要oaCGH平台在空间分辨率、探针长度、灵敏度、特异性等方面的特点及其应用，概括了oaCGH近年来的进展。
综述
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  蛋白质突变体基因库构建方法的研究进展

  张秀艳,何国庆

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 50-56.

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  体外定向进化是蛋白质工程中一个非常有效的设计策略。最近几年，在过去常用的寡核苷酸介导的随机突变、易错PCR和DNA改组等方法的基础上又出现了一些新的定向进化方法。本文对这些方法及其特点加以总结，为解决特定问题选取何种方法提供一定依据。最近研究表明：定向进化和理性设计相结合、定向进化和以结构为基础的计算设计方法相结合正成为蛋白质工程中两个新的发展方向。
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  趋化因子CXCL9/Mig的研究进展

  路慧丽,俞眉,韩伟

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 57-61.

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  趋化因子CXCL9又称为mig，即monokine induced by IFN-γ(IFN-γ诱导的单核因子)，是趋化因子CXC亚族的一员，体内主要由IFN-γ刺激的巨噬细胞和神经胶质细胞产生，体外则可由内皮细胞、粒细胞等在IFN-γ和TLR配体协同作用下产生。CXCL9的受体CXCR3为七次跨膜的G蛋白偶联受体。CXCL9对激活的T淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞具有趋化作用，但是对粒细胞和单核细胞没有作用。本文主要就CXCL9的结构与生化特征，其在免疫、移植排斥、肿瘤治疗等方面所起的作用，进行了较为系统的综述。
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  丙型肝炎病毒（HCV）实验性疫苗的研究进展

  谭文杰,张柯,阮力

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 62-68.

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  丙型肝炎病毒是引起输血相关肝炎及慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要病原，目前尚无有效的治疗与预防手段。本文将综述HCV感染所引起的机体免疫应答及近年来实验性疫苗（主要是DNA疫苗、病毒载体疫苗及联合疫苗）的研究进展。
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  疱疹病毒编码的miRNAs的研究进展

  戚鹏,韩金祥,鲁艳芹

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 69-74.

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  MicroRNAs (miRNAs)是一类长约22个核苷酸的RNA，在数量、序列、结构、表达和功能上具有多样性。目前，通过生物信息学手段和分子克隆方法，已发现了3518种miRNAs，在控制细胞的生长发育、分化、凋亡等过程中发挥着十分重要的作用。最近研究发现某些病毒基因组也能够编码miRNAs，其中大部分为疱疹病毒，这些miRNAs在调控病毒自身表达以及病毒与宿主相互作用方面可能起到重要的作用。找出病毒可能编码的miRNAs，探索其对病毒感染、复制、表达的作用，有助于病毒分子生物学的研究，也会为研发防治病毒的新方法和新途径提供新的思路。
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  我国体细胞克隆牛的研究进展

  程金华,朱化彬,戴蕴平,孙秀柱,王栋,郝海生

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 75-80.

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  近年来，由于体细胞克隆技术在畜牧业生产、疾病治疗、生物学基础理论研究及濒危动物保护等诸多领域所蕴藏的巨大应用价值，克隆效率成为科学界研究的热点问题。本文对克隆技术的相关影响因素进行了综述，研究表明，不同细胞系影响到体细胞克隆牛效率，胎儿细胞和颗粒细胞重构胚的囊胚发育率、犊牛成活率比成年成纤维细胞高。关于卵母细胞和克隆胚胎冷冻保存的研究表明，玻璃化冷冻法可以用于克隆胚胎以及卵母细胞的冷冻保存。在此基础上，讨论了国际上哺乳动物体细胞克隆研究新进展和体细胞克隆的效率，指出体细胞克隆中亟待解决的问题。
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  同位素标记相对和绝对定量技术研究进展

  罗治文,朱樑,谢谓芬

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 81-85.

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  定量蛋白质组学是蛋白质研究的前沿学科。目前常用的定量蛋白质组学研究技术有荧光差异凝胶电泳（DIGE）、同位素亲和标记（ICAT）等。同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术。结合非凝胶串联质谱技术，该技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究，具有较好的定量效果、较高的重复性，并可对多达四种不同样本同时进行定量分析。本文对 iTRAQ 技术的原理、实验方法及应用进展进行了综述。
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  衣藻生物制氢的研究进展

  吴双秀,王全喜

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 86-90.

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  综述了利用衣藻生产氢气作为再生能源的研究进展。分别介绍了衣藻产氢的代谢机理、培养条件、衣藻氢化酶的特性以及利用分子生物学手段、生物信息学手段和生物工程技术提高衣藻生物制氢效率的方法，包括氢化酶的氧耐受性的改造、外源氢化酶基因的表达、影响衣藻产氢的关键基因的筛选、利用缺硫培养基和固定化培养方法提高氢气产量等。最后，还对利用衣藻生物制氢的可行性和经济性进行了分析，对其发展方向提出自己的看法。
产业发展
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  中国重组抗体药物发展的策略探讨

  刘彦君,赵阳,王征

  中国生物工程杂志. 2006, 26(10): 91-95.

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  随着重组抗体药物展示出良好的治疗效果和市场效益，抗体药物的研发逐渐成为生物医药产业发展的主要方向。但是目前国内动物细胞表达水平普遍较低和发酵工艺落后的现状制约了我国抗体药物产业化的发展。本文主要综述了国际抗体药物产业的发展态势，重点比较二氢叶酸还原酶和谷氨酰胺合成酶表达体系、连续灌注和流加培养发酵模式的各自优势，结合我们抗体药物表达、发酵方面的经验，对当前我国抗体药物产业化发展策略进行了探讨，提出抗体药物产业化模式应根据企业对抗体产率、产能和市场经济学的多重考虑选择发酵工艺和发酵规模，应用谷氨酰胺合成酶/CHO-K1表达系统和连续灌注培养工艺可能更适应目前中国抗体产业化的需要。