1农业的现状、问题与发展方向农业是人类发展最早的产业,农业技术是发展最早的科学技术。中国自古以来将江山社稷作为一个国家的根本,江山泛指疆域,社稷即是土地与粮食,这是对农业重要性的最集中的概括;历史上无数次农业欠收成为触发社会动乱甚至改朝换代的直接导火线,在很长时期内,农业也是国家税收的主要来源。工业革命以后,农业在经济上的重要性下降了,但是作为支撑经济发展、维护社会稳定、保证人民生活的基础作用却丝毫没...
白细胞介素24/MDA-7基因是在黑色素瘤分化过程中被分离得到的,具有抑制黑色素瘤增生和促进其终末分化的能力。IL-24作为细胞因子不仅具有免疫调节功能,而且能选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡。这种抑制作用不依赖p53、Rb和p16等抑癌基因,对正常细胞没有影响。白细胞介素24具有显著的选择性抗肿瘤特性,成为肿瘤治疗的研究新热点。
Ⅰ型糖尿病(typeⅠ diabetes mellitus,T1DM)是目前严重危害人类健康的常见病、多发病,全世界约有2%~5%的人患有此种疾病,且呈逐年增长趋势,多见于儿童和青少年。从降糖药物到胰岛素,从胰腺移植到胰岛移植,T1DM的治疗经历了一个漫长的过程。近年来研究发现,由胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESC)、胰腺干细胞及其它组织干细胞等诱导分化为胰岛素分泌细胞(insulin-serectingcells,ISC),可望解决移植过程中存在的供体不足的问题。着重介绍了几种ISC的来源和诱导分化途径,分析了各种途径的优势及不足。
群体感应(QS)是细菌根据种群密度的变化调控基因表达,协调群体行为的机制。除具有种特异性的信号分子AI-1外,近年来发现一类新的信号分子AI-2在调控细菌基因表达中起重要作用。AI-2的结构和生物合成途径已被确定,其产生依赖于一种称为LuxS的蛋白。目前认为AI-2在细菌种间交流中起通用信号分子(universalsignal)的作用。了解细菌的QS调控过程以及种间细胞交流的新机制,有助于对细菌病害进行防治。
C4植物所具有的C4光合途径赋予其较高的光合作用效率,而一些主要的农作物如水稻、小麦、大豆等均为C3作物,光合效率低下。随着生物技术的发展,通过基因工程手段利用C4光合特性来改善C3植物的光合效率进而提高其生物产量逐渐成为植物高光效育种的一个研究热点。综述了目前这一领域的研究进展及存在问题,预测了这一领域的发展前景。
多聚唾液酸(polysialic acid,PSA)是一类线性、均一多聚α2,8连接唾液酸的独特碳水化合物,它主要通过典型的N-连接糖苷键附着在脊椎动物神经系统神经黏附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)上。PSA通过改变NCAM的黏附性调节神经细胞发育、神经导向以及突触形成,从而在神经发育中起关键作用。PSA表达的调节具有时间和结构依赖性,NCAM的唾液酸化是由两种多聚唾液酸转移酶(polysialyltrans ferases)-ST8Sia II(STX)和ST8Sia IV(PST)所催化,它们都属于6个基因编码的α2,8唾液酸转移酶家族。STX和PST都可将多个唾液酸残基转移到含有NeuNAcα2-3(或6)Galβ1-4GlcNAcβ1-R结构的N糖链受体上;两种酶共同作用时远远大于一种酶形成的PSA量。总之,多聚唾液酸转移酶可调节PSA的合成并参与了脊椎动物的神经发育。
植物来源的非淀粉多糖(non-starch polysaccharides,NSPs)是单胃动物饲料中的抗营养因子,其中最主要的是β-葡聚糖和木聚糖,这两种多聚糖可被相应的β-葡聚糖酶和木聚糖酶降解而消除其抗营养特性。转基因植物可以表达具有活性的β-葡聚糖酶和木聚糖酶,并正常生长发育。含有非淀粉多糖酶的转基因植物可直接作为饲料原料或饲料添加剂替代目前广泛在饲料中添加的发酵酶制剂。综述了两种非淀粉多糖酶转基因植物的研究进展,并对存在的问题和进一步的发展趋势进行了讨论。
为对重组蛋白的表达进行直观检测并简化蛋白纯化的步骤,构建了能在大肠杆菌中表达融合蛋白的通用表达载体pHis-EGFP。该载体含有源自表达载体pET-32a的T7启动子、终止子和源自质粒pUC18的ColE1复制子与绿色荧光蛋白报告基因。应用该载体成功地表达并纯化了酵母GGDP(geranylgeranyldiphosphate,GGDP)合酶融合蛋白,结果表明所构建的载体是一个实用的表达载体,并建立了离子交换层析和亲和层析两步纯化融合蛋白的方法。
解旋酶(helicase)在HCV基因组复制中负责RNA的解链,在复制中起着关键的作用。利用反转录PCR,从HCV患者血液中扩增出解旋酶基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,成功构建了HCV解旋酶原核表达质粒pProEXHTb-helicase。重组质粒转化DH5α大肠杆菌,经IPTG诱导表达后,表达产物经SDS-PAGE和Westernblot证实系解旋酶,并用镍离子亲和层析方法获得纯化解旋酶。
目的构建在肝细胞内增强表达成熟人胰岛素的生理调控性人胰岛素原基因重组质粒。方法利用PCR定点突变技术在B-C及C-A连接处已两点突变的人胰岛素原基因上进行B10位突变,并在其上游连接肝细胞特异的3倍体葡萄糖反映元件(GLRE3)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子(IGFBP-1P)。经酶切后将含有调控元件的3点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)插入逆转录病毒载体(pLXSN),脂质体介导转染大鼠肝癌细胞CBRH7919后检测成熟胰岛素表达情况及与含有调控元件的2点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)表达体的表达差异。结果人胰岛素原基因的B10位组氨酸编码序列CAC突变为门冬氨酸编码序列GAC。构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS),酶切、PCR及测序鉴定各段基因碱基序列及连接方向正确。pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS经脂质体包裹转染大鼠肝癌细胞,细胞外液含5.0、25.0mmol/L的葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为5.03±0.72、43.90±2.30mU/L。未进行B10位突变的重组体转染组在同样葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为<2.00、2.10±0.23mU/L。结论成功构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒,该重组体已整合入鼠肝癌细胞基因组,其表达效率显著提高并受葡萄糖生理性调控。
重组病毒载体系统因为具有高效的基因转移能力得到了广泛应用,而病毒包装细胞的转染是重组病毒制备过程中的关键步骤。优化了脂质体DC-Chol/DOPE介导的转染常用的病毒包装细胞系HEK293FT的实验条件,比较了DC-Chol/DOPE、Lipofectamine2000和磷酸钙共沉淀法转染细胞的效率,并且比较了用DC-Chol/DOPE和磷酸钙共沉淀法转染293FT细胞制备重组腺病毒的结果,发现DC-Chol/DOPE对293FT细胞的转染效率以及最终收获的病毒滴度都远高于磷酸钙共沉淀法转染。所以,利用DC-Chol/DOPE转染293FT细胞制备重组病毒是一种简单、高效、成本低廉的方法。
以SARS冠状病毒(BJ01株)基因组RNA为模板,经RT-PCR扩增得到SARS-CoVnsp8基因,并克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pNSP8E。pNSP8E转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达出可溶性的GST-nsp8融合蛋白,经亲和层析和自剪切获得了高纯度nsp8蛋白。以nsp8为抗原免疫家兔,制备了nsp8的多克隆抗体,为下一步研究其在病毒感染的细胞中的功能奠定了基础。
以研究外源基因有效发送至靶细胞并高效表达为目的,为了获得能提高外源基因在机体内表达量的增强剂,以pCMVβ-gal作为报告基因,分别辅以油酸和透明质酸酶两种不同的生化试剂,注射小鼠后肢腿部肌肉。通过检测在两种不同的生化试剂作用下,pCMVβ-gal在机体内表达量的差异,以期获得能提高外源基因表达量的增强剂。结果证明油酸和透明质酸酶均能有效提高pCMVβ-gal在小鼠体内的表达量,其中透明质酸酶引起的增强效果更为显著,是较好的基因表达增强剂。
提取经新城疫病毒诱导培养的奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛α干扰素成熟蛋白基因,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,测序结果表明,扩增片段为牛α干扰素成熟蛋白序列,与Genebank上发表的α1干扰素序列同源性为98%。然后将特异性片段连接到含分泌信号肽序列的Pichiapastoris表达载体pPICZαA上,将重组质粒经SacI酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了BoIFN-α在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为23kDa,比其推导结果(20kDa)略大,推测可能是因为表达产物发生了一定程度的糖基化。细胞病变抑制法结果表明,重组牛IFN-α具有较高的干扰素活性,约为4.1×105U/ml,经微量蛋白测量仪测得,其表达量约为80μg/ml,比活为5.1×106U/mg。
根据代谢工程原理,采取多拷贝整合策略,利用整合载体pYMIKP,将来自嗜热细菌Thermusthermophilus的木糖异构酶(XI)基因xylA和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)自身的木酮糖激酶(XK)基因XKS1,插入酿酒酵母工业菌株NAN-27的染色体中,得到工程菌株NAN-114。酶活测定结果显示,NAN-114中XI和XK的活性均高于出发菌株NAN-27,表明外源蛋白在酿酒酵母工业菌株中得到活性表达。对木糖、葡萄糖共发酵摇瓶实验结果表明,工程菌NAN-114消耗木糖4.6g/L,产生乙醇6.9g/L,较出发菌株分别提高了43.8%和9.5%。首次在酿酒酵母工业菌株中建立了XI路径的木糖代谢途径。
利用PCR扩增得到米曲霉(Aspergillusoryzae)单宁酶(tannase)基因的编码序列,经DNA测序证实单宁酶基因已成功克隆,然后将其连接到黑曲霉的表达载体ANED2-SP2上构建单宁酶基因表达载体。将构建好的单宁酶基因表达载体通过原生质转化法导入黑曲霉菌株ST31中进行表达研究。结果表明重组菌株的单宁酶活力最高为104.02U/ml发酵液,比原始出发菌株米曲霉提高2~3倍。研究构建了黑曲霉的高效转化体系,提高了黑曲霉表达系统的应用水平,为其它新酶的研究提供有价值的参考。
目的:探索有机溶剂体系中酶法酸解猪油与辛酸制备减热量型功能性脂的最佳反应条件。方法:采用响应曲面法中的3水平5因子2星点部分因子试验设计,评价酸解反应中的5个关键因素,即酶量、反应时间、反应温度、底物比率和水分添加量及其交互作用对辛酸插入率的影响,确定最佳反应条件。结果:建立了辛酸插入率对5个变量的一个2次多项式数学模型,该模型极显著(P<0.0001),拟合优度良好。通过主效应分析,得出每个因子对模型的贡献程度从大到小依次为反应温度(负效应)>底物比率>反应时间>酶量(在实验范围内,水分不影响辛酸插入率)。借助模型方程产生的等高线图及统计软件,分析得出最大辛酸插入率下各个因子的最适水平分别为酶量16%,反应时间36h,反应温度50℃,底物比率3.8,水分添加量5%。在此条件下辛酸插入率达到了50.5mol%,与模型预测值50.7mol%非常吻合。结论:应用响应曲面法对有机溶剂体系中酶法酸解猪油与辛酸制备减热量性脂的反应条件进行优化是合理可靠,科学迅速的,且有效的。
用硫酸铵分级沉淀、离子交换和HPLC层析等方法,从长白山药用真菌树舌的菌丝体中分离纯化了一种凝集素(Ganoderma applanatum lectin,简称GAL),SDS-PAGE检测其为单一蛋白条带。经过SDS-PAGE测得其亚基分子量为15kDa左右,HPLC分析分子量为58kDa左右,表明GAL由4个亚基组成。氨基酸组成分析表明,GAL中甘氨酸含量较高,不含蛋氨酸和色氨酸,中性糖含量约11.2%。圆二色CD谱显示其含有3.6%的α螺旋、46.8%的β转角和49.6%无规则卷曲,不含有β折叠。GAL可以凝集供试的2种动物血和3种血型人血的血红细胞,但对不同来源的血红细胞凝集滴度不同。糖抑制实验表明,只有棉籽糖和D-松三糖部分抑制GAL的凝血活性。GAL具有较好的热稳定性且其凝血活性不受Ca2+、Mg2+和Zn2+等二价阳离子的影响。
根据总RNA完整性、纯度和得率筛选出适合多花蔷薇幼嫩根、叶总RNA的提取方法。结果表明,以CTAB/酸酚法提取的扦插苗根系总RNA、以LiCl-尿素法提取的扦插苗根、叶总RNA以及采用RNeasyPlantMiniKit试剂盒的改进方法提取的组培苗嫩叶总RNA电泳有清晰明亮的28S、18S条带,无降解;其A260/A280值为1.73~2.04,表明总RNA质量好。RT-PCR结果进一步证实所提取的总RNA能够用于分子生物学的各种下游实验。RNA得率分别为:根系和组培苗嫩叶120-140μg/g(fw),扦插苗嫩叶190-230μg/g(fw)。CTAB/酸酚法提取的嫩叶总RNA、SDS/酸酚法提取的根、叶总RNA有多糖污染,且有明显降解。TotalRNAisolationsystem(Z5111,Promega)试剂盒不适合提取多花蔷薇各组织总RNA。
目前通过遗传转化技术获得了许多植物的转基因植株,一些重要农作物转基因新品种已进入产业化阶段,展现出极好的应用前景。但随着研究的不断深入,在如何提高遗传转化效率和转基因安全性等方面,一些新的技术和方法不断出现并得到应用,如胚状体再生系统、叶绿体转化系统、超声波辅助农杆菌介导法、位点特异重组MATvector系统、正选择系统以及新的转基因分子检测方法,使遗传转化技术向高效、安全方向发展,新一代的转基因植物也将会更适应人们和生态环境的需求。
Fractogel○REMD是合成的聚甲基丙烯酸酯树脂,十几个官能团排布在线形聚合物长链上,称为“触角”,所有的“触角”都是通过共价键结合到聚合物骨架上,生物分子更加容易和“触角型”介质的官能团结合,并且可以大大降低生物分子和介质基质的非特异性相互作用,提高生物分子的回收率。对于工业规模的病毒纯化或病毒去除操作,Fractogel○REMD“触角型”介质可以确保获得高重现性的分离结果和纯度符合要求的产品。1病毒纯化最近有不少...
