高效表达重组蛋白 ,对于生物制药意义重大。大多数药用蛋白是糖蛋白 ,中国仓鼠卵巢细胞 (Chinesehamsterovarycell,CHO)是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。影响外源蛋白在CHO细胞中表达的因素很多 ,从CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等方面对CHO高效表达加以阐述 ,同时提出存在的问题和未来的发展方向。
鼠疫 ,由于其强烈的传染性和极高的致死率 ,使得人们在应对它时 ,必须侧重于早期的防治。传统疫苗存在安全隐患 ,且存在效率低 ,接种反应率高以及不能保护人体免受肺鼠疫侵害等缺陷。近年来生物技术的迅速发展 ,为开展对鼠疫传统疫苗的改进和新疫苗的研究创造了条件 ,而这些研究当中 ,成果最为丰富的当属亚单位疫苗。目前鼠疫亚单位疫苗的研究大多围绕对鼠疫杆菌免疫原性起决定作用的两种主要抗原成分 (F1抗原和V抗原 )展开 ,按此研究方向浅谈其研究进展。
降钙素基因相关肽家族是一类多功能的激素家族 ,参与人体的多种生物学功能 ,与多种疾病有关。降钙素基因相关肽受体包括降钙素受体 (CTR)和降钙素受体样受体 (CRLR) ,CTR可以独自与降钙素结合 ,而CRLR必须与一组称作受体活性修饰蛋白 (RAMPs)的蛋白质共同作用才能发挥生物学功能。综述CTR的研究概况及CRLR与RAMPs相互作用的机制和表达调控 ,以期为人们设计新型药物提供参考。
作为一项新的反向遗传学技术 ,RNA干扰技术正在越来越多地应用于包括鉴定基因功能、疾病治疗、植物病毒抗性研究在内的多项研究领域。在鉴定基因功能研究中 ,由于该技术的操作简便性 ,使得在基因组水平进行大范围的基因功能鉴定成为可能 ;而针对致病相关基因、致病病毒基因组进行RNA干扰 ,可以有效抑制病情恶化 ,有可能成为未来疾病治疗的重要手段 ;同时 ,将RNA干扰技术应用于植物抗病毒研究 ,为工程化植物抗病毒遗传育种提供了一个高效、特异的抗性获得手段。对RNA干扰技术在上述三个研究领域的应用作简要综述 ,并对应用过程中需注意的问题进行了探讨 。
水稻是全球近一半人口赖以生存的基本食粮。随着人们生活水平的提高 ,人们对稻米品质的要求越来越高 ,水稻生产需要改善稻米的品质 ,才能适应人们的需求变化。世界上超过 40 %的人们在受到微量营养不良的折磨 ,特别是在许多发展中国家 ,这个百分比还在增加。因此 ,提高水稻微量营养物质含量对于改善人们微量营养缺乏状况很有必要。同时 ,利用转基因技术生产具有药用价值的水稻越来越受到重视 ,应用前景十分诱人。就近十年来国内外的研究进展作一综述。
堆肥化是处理有机固体废物的主要方法之一。但传统堆肥法存在历时长、肥效低等问题 ,因此加速腐殖化进程可提高堆肥效率和堆肥质量。综述了堆肥中降解木质素的微生物种类的腐殖质的组成 ,介绍了木质素降解与腐殖质形成的关系 ,最后阐述了堆肥中各木质素降解微生物对腐殖质形成的作用。
酶工程的研究已经发展到分子水平 ,在体外通过基因工程、化学、物理等手段改造酶分子结构与功能 ,大幅提高了酶分子的进化效率和催化效率 ,生产有价值的非天然酶。对酶工程学若干“热点”和前沿课题的研究、应用进行了概述 ,分析了国际上酶工程研究及应用技术、手段、方法 ,包括体外分子进化、核酶和抗体酶的设计、酶分子的定向固定化技术、酶蛋白分子的化学修饰、融合酶、人工合成及模拟酶等技术 ,并展望了酶工程的技术进步和应用的新进展。
综述了γ 多聚谷氨酸 (γ PGA)的研究进展。γ PGA是一种高分子可降解生物材料 ,目前 ,高产菌株的产量为 5 4 45～ 5 8 0 8g L ,多用E 培养基 ,发酵温度为 37℃ ,影响产率的因素为碳源、NaCl浓度、通气量和金属离子。用超滤和乙醇沉淀的方法提取分离纯化γ PGA。讨论了γ PGA生物合成机制及其相关基因的克隆、定位和功能。最后简述了γ PGA的应用与展望。
根据微生物基因 (DNA)多态性来研究微生物的多样性 ,是建立在多聚酶链式反应 (PCR)基础之上分子生物学的新方法 ,克服了传统微生物培养方法的限制。从理论、实验及应用角度出发 ,介绍了几种在微生物生态学中应用较为广泛的分子生物学技术 ;详细阐述了微生物生态学中分子生物学的一种新研究方法———末端限制性片段长度多态性 (T -RFLP)技术 ,该技术作为一种研究微生物群落特征的理想方法已经越来越受到人们的重视。
目的 :通过重建端粒酶活性延长胎儿肌肉源间充质干细胞寿命 ,并对其成神经潜能进行研究 ,为组织工程神经修复提供种子细胞。方法 :将人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因通过脂质体转染法导入胎儿肌肉源间充质干细胞 ,RT PCR检测hTERTmRNA的表达 ,TRAP PCR检测细胞端粒酶活性。用bFGF诱导已重建端粒酶活性的肌肉源间充质干细胞向神经细胞分化 ,免疫荧光及免疫印迹法检测分化情况。结果 :转染hTERT的胎儿肌肉源间充质干细胞能稳定表达端粒酶活性。转染后传 75代的细胞经bFGF诱导仍维持着自我更新及向神经细胞分化的潜能 ,且无恶性转化倾向。结论 :重建端粒酶活性可延长胎儿肌肉源间充质干细胞寿命并维持自我更新及成神经潜能 ,为建立组织工程标准细胞系提供了新的实验手段
应用RT PCR方法扩增了编码猪瘟病毒石门株 (CSFVshimenstrain)囊膜糖蛋白E2全基因 ,然后将其克隆到pMD 1 8T质粒中 ,获得重组质粒pMD E2。再以pMD E2为模板 ,另行设计两对引物 ,同时扩增其中一段适于在E .coli中表达且抗原反应性较好的基因片段 (E2蛋白A D抗原区基因序列 ) ,将扩增的两片段串联插入原核表达载体pET 32a中构建成重组质粒pET 2e。用酶切和序列分析鉴定插入目的基因的正确性。SDS PAGE和Western blot分析表明 ,经pET 2e转化、IPTG诱导的受体菌可表达目的蛋白 ,克隆在硫氧还蛋白 (thioredoxinprotein ,TrxA)基因下游的E2蛋白基因与TrxA基因获得了高效融合表达 ,并且具有免疫学反应活性 ,这为猪瘟的血清学诊断方法的建立打下了基础 。
以离子交换、疏水作用、HPLC和凝胶过滤层析等方法对山羊乳腺生物反应器表达的人促红细胞生成素 (erythropoietin ,EPO)进行了分离纯化 ,初步探讨了其分离工艺 ,结果得到了纯度达到 96%以上的纯品 ,所纯化的EPO分子质量为 32kDa ,糖基化程度根据理论分子质量测算为40 %。Western blot证明所得纯化产品具有天然EPO免疫原性 ,N端氨基酸序列测定与文献报道一致 ,ELISA检测免疫活性为 2 4 0 0 0 0IU mg,表明通过 4步纯化步骤可以得到高纯度的产品 ,为今后工艺放大提供了有力的实验依据。
以细胞膜穿透肽 (Penetratin)基因为主要模板序列 ,融合肝细胞膜受体结合蛋白的DNA序列 ,设计一段肝细胞基因治疗载体的特异基因序列 ,构建并表达了肝细胞特异性载体体系及 3种对照体系。然后进行肝细胞的穿膜实验 ,细胞荧光显色结果提示肝细胞特异性载体体系可以有效地介导外源蛋白EGFP的基因进入肝细胞 ,并在肝细胞内表达。结论提示 ,所构建的载体体系有可能为肝细胞基因治疗提供一种新型的非病毒基因治疗载体。
根据GenBank发表的传染性法氏囊病病毒 (IBDV) 5 2 70株VP2 基因序列 ,设计合成了 1对特异扩增IBDVVP2 基因的引物。以IBDV超强毒河南分离株HN0 1感染发病鸡法氏囊组织中提取病毒RNA来制模板 ,利用RT PCR扩增出了 1 .4kb的VP2 基因 ,将其克隆到pIREShyg载体上 ,构建了pIRES VP2 真核表达载体。然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO细胞 ,通过潮霉素筛选得到阳性克隆 ,间接免疫荧光实验 (IFA)鉴定VP2 在CHO细胞中的表达 ,并用RT PCR的方法从转录水平证实VP2 在CHO k1细胞中的表达 ,最终建立了CHO VP2 细胞株 株。
利用PCR技术 ,从枯草杆菌DB40 3染色体上扩增出谷氨酰胺转胺酶基因 ,将其克隆到大肠杆菌载体pET32a( + )中 ,成功构建谷氨酰胺转胺酶表达载体pET32-BTGase ,并转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)。重组克隆在IPTG诱导下 ,表达出硫氧还蛋白 谷氨酰胺转胺酶 (Trx-BTGase)融合蛋白 ,表达量占细菌总蛋白量的 2 6%。利用金属螯合层析纯化菌体裂解上清中表达的融合蛋白 ,纯度超过 80 %,再通过分子筛层析进一步纯化得到融合蛋白纯品。酶活性分析表明表达的Trx-BTGase融合蛋白具有交联蛋白的活性 ,并发现Trx-BTGase融合蛋白和经凝血酶酶切后得到的BTGase单体都能催化牛血清白蛋白的聚合反应
利用PCR技术从Streptococucspyogenes的基因组DNA中扩增了链激酶的编码基因ska,并进行了序列分析 ,利用基因删除及定点位变技术获得了删除了C-末端 42个氨基酸残基编码区的突变链激酶基因skaΔC42 ,第 5 9位Lys残基突变为Glu的突变链激酶基因skaK5 9E以及删除C-末端 42个氨基酸且第 5 9位Lys残基突变为Glu的突变链激酶基因skaΔC42K5 9E ,将ska及其三种突变体分别克隆到表达载体pET 1 5b上 ,构建分别表达野生型链激酶 (SK)、C-末端缺失 42个氨基酸残基的突变体 (SKΔC42 )、第 5 9位Lys残基突变为Glu的突变体 (SKK5 9E)及C-末端缺失 42个氨基酸且第 5 9位Lys残基突变为Glu突变体 (SKΔC42K5 9E)的表达载体pSK ,pSKΔC42 ,pSK K5 9E ,pSKΔC42K5 9E ,分别转化E .coliBL2 1 (DE3) ,IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了高效表达 ,经亲和层析、离子交换层析及分子筛层析 ,获得了rSK、rSKΔC42、rSKK5 9E及rSKΔC42K5 9E ,活性分析表明rSK与其三种突变体具有相同的比活性。
研究揭示细胞膜磷脂脂肪酸组成与酵母菌耐酒精能力的一种新颖关系及其机制。分别培养于添加 0 6mmol L棕榈酸、亚油酸或亚麻酸不同条件下的自絮凝颗粒酵母 ,其细胞膜富含各自所添加的脂肪酸。细胞膜富含棕榈酸、亚油酸或亚麻酸的三种菌体于 30℃经 2 0 %(v v)酒精冲击 6h的存活率分别为 5 2 %、1 8%和 0。通过考察三种菌体于 30℃在 1 5 %(v v)酒精冲击下的细胞膜透性发现 ,细胞膜富含棕榈酸的菌体的胞外核苷酸平衡浓度分别仅为细胞膜富含亚油酸或亚麻酸菌体的 48%和 32 %,其细胞膜透性系数 (P′)分别仅为后者的 37%和 2 0 %,且三者的胞外核苷酸浓度和P′由小到大的排列顺序均与它们的存活率由高到低的排列顺序完全一致。因此 ,细胞膜富含棕榈酸的菌体具有较强的耐酒精能力是与其在高浓度酒精冲击下可维持较低的细胞膜透性密切相关的 的。
从黑龙江省巴彦县亚麻厂不同发酵时期的沤麻液中 ,分离得到两株果胶酶产生菌MHZP 0 1和MHZP 0 2 ,经初步鉴定为芽孢杆菌属 (Bacillus)。在温度为 33～ 37℃ ,pH 5～ 6,工业级原料C N(质量比 )为 1∶1时 ,为这两株菌的最佳培养条件。
目的 :探讨将多肽固相合成技术用于检测抗精子抗体的ELISA试剂盒制备。方法 :以多肽固相合成法合成特异性精子肽 ,并经高效液相纯化分析及质谱分析。以此合成精子肽包板制备检测抗精子抗体的ELISA试剂盒 ,检测血清标本的AsAb。结果 :HPLC结果显示 ,合成的精子肽纯度达 98.26%;质谱分析结果主峰分子质量与理论值一致。采用合成多肽抗原建立了检测抗精子抗体的酶联免疫吸附测定方法 ;不明原因不育患者组与对照组间AsAb发生率呈非常显著差异(P <0,005 )。结论 :本固相合成法可获得高纯度特异性精子肽 ;该精子肽包板的ELISA试剂盒可靠简便。
免疫芯片是指包被在固相载体上的高密度抗原或抗体微点阵 ,是继基因芯片之后提出的一种新型的生物芯片。在检测大分子物质葡萄球菌肠毒素 (SE)时采用双抗体夹心法。检测时将SEA、SEB、SEC加入反应池中 ,反应后清洗掉未结合的SE ,再加入相应的标记抗体 ,形成固定抗体 待测物 标记抗体的夹心式结构。对影响免疫芯片检测效果的条件进行了优化 ,按优化后的条件进行SEA、SEB、SEC的检测 ,结果表明荧光信号强度随待测物浓度的增加而增加 ,当浓度高于一定值时 ,荧光信号强度趋于一定值 ,本法最低可检测 0.0 1 μg ml的SEA和SEB及 0.1 μg ml的SEC。将此项技术应用于环境和食品中污染物检测领域 ,将会使卫生监督工作水平得到明显的提高。
资金不足、融资困难是我国生物产业发展面临的重要问题之一。我国生物产业融资中存在一些问题 ,既包括高新技术产业在创业初期在融资中遇到的普遍性问题 ,也包括生物产业发展遇到的特殊问题。分析研究我国生物产业融资状况、存在的问题 ,并提出政策建议。
