目的:探讨鼠李糖(rhamnose,Rha)修饰对曲妥珠单抗(trastuzumab,Tra)Fc效应功能的影响。方法:将二硫键还原的Tra分子与含交联剂的Rha衍生物分子偶联,构建Tra-Rha偶联物。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹和高效液相分子排阻色谱对偶联物进行表征,并通过流式细胞术评估偶联物的HER2抗原亲和水平,免疫荧光和流式细胞术评估偶联物的抗Rha抗体募集能力。最后,通过在体外检测偶联物介导的补体依赖的细胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity,CDC)和抗体依赖细胞介导的吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis,ADCP),评估其Fc效应功能的增强水平。结果:成功构建了一款Tra-Rha偶联物。亲和实验和抗体募集实验表明Tra-Rha偶联物保留了良好的HER2抗原结合能力,并能将高水平抗Rha抗体选择性募集至靶细胞表面。CDC实验显示,Tra-Rha偶联物可介导显著的CDC效应对HER2阳性的SKBR3和SKOV3细胞进行杀伤,最高杀伤率分别为75%和70%,而相同条件下未修饰Rha的Tra则不能介导CDC。ADCP实验则显示,在SKBR3和SKOV3细胞中,Tra-Rha介导的ADCP水平较Tra分别提高了2.3倍和1.2倍。结论:Rha修饰可作为一种经济高效的策略,用于同时增强Tra的多种Fc效应功能,进而改善Tra的治疗指数。
目的:了解FcγRIIb对小鼠巨噬细胞天然免疫及抗病毒免疫作用的影响。方法:构建鼠源FcγRIIb原核表达质粒pET28a-FcγRIIb,将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达,采用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化。以纯化后的重组蛋白作为抗原,免疫兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测血清效价,利用Western blotting技术鉴定抗体特异性,高免血清经饱和硫酸铵溶液粗纯和ProteinG Sapharose精纯获得兔抗鼠FcγRIIb多克隆抗体。以该抗体激活小鼠腹腔巨噬细胞表面的FcγRIIb,利用荧光定量PCR技术检测MHV感染上述细胞后相关细胞因子的mRNA转录水平。结果:单独激活FcγRIIb 12~48 h时巨噬细胞中TLR3、IRF3、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α和IL-1β的mRNA转录水平上调,免疫抑制因子TGF-β的mRNA转录水平下调。此外,在MHV感染小鼠腹腔巨噬细胞12~48 h时,与未激活组相比,FcγRIIb 激活后可上调细胞中TLR3、IRF3、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α和IL-1β的mRNA转录水平,下调TGF-β的mRNA转录水平,且其病毒拷贝数及病毒滴度低于未激活组。结论:研究证明FcγRIIb的活化能促进小鼠腹腔巨噬细胞天然免疫因子产生,同时具有一定抗病毒作用,为进一步探究FcγRIIb在MHV感染过程中的作用奠定了基础。
基因元件的标准化和模块化为日益复杂的遗传系统改造设计提供了参考。目的:通过探究5'-非翻译区(5'-untranslated region, 5'-UTR)在大肠杆菌体内外对翻译起始调控的一致性,挖掘通用型5'-UTR序列为模块化工程增添具有良好特征的遗传元件。方法:构建包含25 nt的5'-UTR随机文库化转至大肠杆菌中,通过测量样品荧光值(Flu)和OD600来量化其体内的相对活性值;利用大肠杆菌BL21 Star(DE3)细胞抽提物进行体外蛋白质表达,通过测定样品Flu来量化体外的相对活性值;依据5'-UTR的碱基分布、最小自由能等对文库序列特征进行分析;将得到的体内外真实活性值进行相关性分析并计算皮尔逊相关系数。结果:成功构建的554个5'-UTR变体文库在体内外蛋白质表达系统中表现出中等相关性(Pearson’r=0.64);其中,相对活性值高的5'-UTR序列富含AG,并且其在体内外均呈现自身最小自由能较大,而与16S rRNA杂交的自由能较小;文库数据量大小使体内外相关性分析产生一定的波动性但较为微弱;最后,发现高活性区间内的5'-UTR序列在体内外相关性较高,并从文库中优选出3条作为通用型5'-UTR应用于代谢工程与合成生物学领域。结论:体内外蛋白质表达的中等相关性推动了体外快速表征在研究体内生物合成中的拓展与应用,筛选出的通用型5'-UTR为基因线路的遗传设计提供了选择。
近年来,随着多种双特异性抗体药物的成功上市和基因工程技术的发展,双特异性抗体已成为抗体领域的研究热点。由于双特异性抗体结构复杂,其在生产过程中往往更容易产生聚体,不仅为下游纯化增加了难度,也提高了实验成本。为减少生产过程中聚体的产生,以表达抗CD3×Claudin 18.2双特异性抗体的CHO-K1细胞为研究对象,在2 L生物反应器上利用试验设计(Design of Experiment,DOE)法探究多种工艺参数对CHO-K1细胞合成抗CD3×Claudin 18.2双特异性抗体过程中聚体形成的影响,建立了工艺参数与聚体含量间的模型,确定了优化的工艺参数控制范围,并在200 L生物反应器中对优化的工艺条件进行了验证。DOE结果显示:pH、补料浓度和碳源浓度对聚体形成影响显著且均呈负效应。当pH为7.0~7.2、补料浓度为5.5%和碳源浓度为8~10 g/L时,200 L生物反应器中的验证结果显示聚体的含量为(27.62±4.55)%,与模型预测的结果具有一致性。
目的:利用CRISPR/Cas9技术构建POLQ基因敲除293T细胞系,并探讨该敲除细胞系在外源基因定点整合方面的应用。方法:构建靶向POLQ 基因的pX330-sgRNA打靶载体,通过T7EI酶切验证,选取打靶效率最高的载体,转染293T细胞;利用流式细胞分选术、稳定单细胞克隆培养、TA克隆测序及蛋白质印迹等方法验证POLQ敲除情况;利用靶向AAVS1和FBL位点的含GFP/mCherry报告基因同源打靶载体,评估敲除的293T POLQ-/-细胞系在外源基因定点整合效率的变化,并通过测序方式验证供体报告载体是否定点整合到基因组中;最后分析POLQ敲除对293T细胞增殖和存活率的影响。结果:成功在293T细胞中稳定敲除POLQ基因;通过报告基因实验验证,敲除细胞系中外源基因定点整合效率平均提高2~7倍,且敲除POLQ基因对293T细胞系增殖和存活率没有明显影响。结论: 成功利用CRISPR/Cas9技术构建具有高效定点整合能力的POLQ基因稳定敲除293T细胞系,为进一步利用该细胞系高效制备稳定整合外源基因(包括抗体基因)工程化细胞系奠定基础。
鉴于传统养殖和屠宰获取肉类食品的方式,环境污染、资源浪费和多种有害成分残留等方面问题不断加剧,以及未来绿色低碳发展所面临的现实问题,随着“细胞农牧”科技的兴起,国内外研究者和企业家将目光转向了具有综合优势的细胞培育肉生产新模式。与以多种蛋白质资源为原料进行调制加工的“植物人造肉”不同,动物细胞培育所生产细胞培育肉,在营养品质和口感上更接近“真肉”,有望成为细胞合成生物技术生产替代蛋白质的未来发展新热点,已成为新兴食品科技和产业与投资界的新宠。将细胞培育成具有一定规模和效率的“培育肉”,将对生长效率与周期,以及规模化生产的成本控制具有基础性作用,其中最为关键的是种子细胞及其永生化扩增能力。主要就国内外有关动物细胞培育肉概况、种子细胞优选与实现其永生化策略,以及动物细胞培育肉方面科技伦理等进行较为系统的综述和分析,为我国开展相关研究和细胞培育肉产业提供重要参考。
抗体药物在生物医药行业所占比重持续增加,抗体高效表达需要在合适的系统中进行,载体在这一过程中尤其重要,可以参与一系列抗体生产步骤:搭配合适的元件来筛选阳性、高表达克隆,选择轻重链的最优表达比例,稳定基因转录,增强翻译效率,对抗体进行正确的翻译后修饰等。对哺乳动物细胞表达载体构建所涉及的启动子、增强子、绝缘子、支架/基质附着区、信号肽、多顺反子策略、筛选系统、加尾信号以及用于增强目的基因表达所涉及的遗传工具等研究进展进行讨论,以期全面了解哺乳动物细胞重组抗体表达所涉及关键点,克服与之相关的挑战,进而推动抗体疗法发展。
目前,动物疫苗佐剂主要以铝佐剂和油乳佐剂为主,存在免疫效果差、副作用明显等问题,亟须安全有效的新型佐剂替代。随着纳米颗粒在佐剂应用领域研究的深入,其良好的免疫增强作用、生物相容性、纳米尺寸效应、抗原负载能力、抗原缓释效应和组织靶向性等优势引起了研究人员的极大关注,有望作为新型动物疫苗佐剂用于动物疾病防治。迄今为止,针对如猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪流行性腹泻、非洲猪瘟、牛病毒性腹泻、口蹄疫、禽流感和新城疫等重要动物传染病纳米疫苗的研究取得了重大进展。综述总结了国内外动物疫苗纳米颗粒佐剂的应用及作用机制,分析了影响纳米颗粒佐剂免疫增强效果的理化因素,以期为新型动物疫苗佐剂研制及开发提供参考。
氨基酸是生物体的重要组成物质,为生命活动提供了物质基础。由于氨基酸种类多样,可以通过脱水缩合反应生成多肽,并通过数个多肽盘曲折叠产生蛋白质,对多肽和蛋白质的结构和功能造成影响。因此,识别不同氨基酸并对氨基酸序列进行读取具有重要意义。纳米孔检测技术是一种新型单分子传感技术,具有无须标记、灵敏度高、检测速度快等优点,广泛应用于核酸、蛋白质和多糖等待测物的检测。综述了近年来生物纳米孔在氨基酸检测及氨基酸序列识别中的应用,具体囊括了单个氨基酸的识别区分、不同多肽和蛋白质的检测以及潜在氨基酸序列技术的开发,并对相关发展前景提出展望。
随着“提高全民健康素养”的号召深入人心,自主健康监测的需求也逐渐扩大,代谢物分析在健康管理过程中占据不可替代的重要作用。与质谱法、色谱法和光谱法等传统分析技术相比,电化学传感器因其选择性强、灵敏度高和检测范围宽,在生物医学、环境科学、材料科学等领域均显示出巨大的应用潜力。目前,科研工作者已经开发出多种面向生物代谢物检测的电化学传感器,用于确定离体体液中疾病标志物的水平或进行在体实时动态监测。以生物分子检测为切入点,综述了便携式、植入式和可穿戴式新型电化学传感器在疾病相关代谢物分析中的应用进展,并对这些传感装置进行总结和比较,以期为生物传感器的创新及临床应用拓展提供参考。
橄榄酸(olivetolic acid, OLA),属于单芳香族化合物,是一种经由橄榄醇合成酶(olivetol synthase, OLS)和橄榄酸环化酶(olivetolic acid cyclase, OAC)协同催化的次生代谢产物。OLA具有抗菌、抗细胞毒性、抗惊厥和光保护等药理特性。此外,OLA还是大麻素生物合成的关键前体,为大麻素提供聚酮核部分。随着对OLA应用价值的深度挖掘及在医药工业的需求增加,实现其规模化生产迫在眉睫。生物合成法因其反应条件温和可控、绿色、可循环等优点,成为合成OLA的首选方法。通过综述OLA生物合成途径和关键酶的作用机制,讨论OLA生物合成策略的研究进展,旨在探索利用合成生物学技术生产OLA的潜力,为OLA的规模化生产提供理论依据。
近年来,合成生物学因其所具有的革命式、颠覆式创新潜力,已经成为世界各国必争的科技战略高地,正在引发新一轮的科技与产业国际竞争。对比分析国内外合成生物学领域的专利发展态势,梳理全球合成生物学在元件工程、线路工程、代谢工程、基因组与细胞工程的基础研究前沿,并对合成生物学在医疗、食品、农业等领域的应用进行归纳。最后针对国家宏观支持、专利技术应用、基础研究发展三个方面提出对我国合成生物学进一步发展的启示与建议。
产业发展指数是衡量某区域范围内一个产业发展程度的数据标准,是对某一个产业综合评估所得出的标志性数据,可清晰反映产业的发展趋势、存在的问题及未来的发展潜力。中国生物医药发展指数充分考虑了生物医药产业的战略性、高技术、高成长、高风险等特征,从资源投入、绩效产出、企业创新和国际影响四个维度构建指标体系,以求全面反映中国生物医药产业的发展水平及各区域的发展差异。
