纳米颗粒的准确表征对于推动生命科学认知、改善疾病诊断和治疗以及促进纳米科技的发展至关重要。由于纳米颗粒存在高度的个体差异性和异质性,迫切需要开发单颗粒水平的快速检测技术。基于瑞利散射与鞘流单分子荧光检测技术研发的纳米流式检测技术(nano-flow cytometry,nFCM),能够以每分钟高达10 000颗粒的速率实现对人工合成纳米颗粒(7~500 nm)以及细胞外囊泡、病毒等天然生物纳米颗粒的粒径分布、颗粒浓度和生化性状的高灵敏、高选择性、高通量多参数分析。通过讨论nFCM研发的重要性、挑战、进展以及产业转化,回顾该技术在纳米颗粒研究中的应用,并展望其未来的应用前景。
流式细胞术(flow cytometry,FCM)是一种经典的单细胞分析技术,可快速定量分析处于快速直线流动中的细胞或生物颗粒的多参数特征,并同时进行分选,具有重要的生物医学应用价值。基于荧光的传统FCM发展了近五十年,技术已逐渐成熟。然而,传统的FCM需要侵入式地从生物体中抽血取样,会扰乱生物体自身的生理环境并限制实时检测。活体流式细胞术(in vivo flow cytometry,IVFC)作为一种新兴的技术,可实现对于活体内细胞样本的无创检测。基于荧光激发、光声效应、光热效应等原理,已开发出一系列多种功能的IVFC。通过回顾不同类型IVFC的发展脉络和基本原理,对比分析其基本参数,并综述基于IVFC的循环肿瘤细胞的研究发现和新型无标记检测的最新研究成果,有助于进一步理解IVFC的发展趋势和应用前景。
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)相关弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是一种罕见的疾病,其恶性程度高、治疗复杂、预后较差、死亡率高。目前,临床上广泛采用国际预后指数(international prognostic index,IPI)评估DLBCL患者的预后,但由于HIV感染后的特殊性,HIV相关DLBCL患者具有不同于HIV阴性DLBCL的临床特点,IPI不能精确区分出高风险、预后差的HIV相关DLBCL患者。针对目前HIV相关DLBCL预后评估面临的挑战,对其相关生物学标志物的研究进展进行论述,为提高HIV相关DLBCL患者预后评估的准确性提供参考。
拷贝数变异(copy number variations,CNVs)是由基因组发生重排引起的,通常指长度为几千个碱基对以上的基因组片段的拷贝数增加或减少,表现为亚显微水平的缺失、重复和片段性重复等。CNVs与许多疾病相关,是导致人类出生缺陷、发育疾病和癌症等疾病的重要机制之一。深入了解基因组中的拷贝数变异对于更好地理解基因与疾病之间的关系、遗传-环境相互作用以及基因组变异与物种进化之间的关联具有重要意义。 因此,与CNVs相关的疾病研究已经成为当前医学遗传学研究中的重要领域。对亚显微水平CNVs致病的分子机制、检测方法以及最新进展进行综述。
目的:探究淋巴结滤泡辅助T细胞淋巴瘤-血管免疫母细胞亚型(nTFHL-A)免疫表型特征,探讨流式细胞术在其中的诊断价值。方法:搜集华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科2010年1月至2023年8月初诊的nTFHL-A患者227例,回顾性分析初诊nTFHL-A患者的免疫表型特征。结果:胞膜CD3表达减弱或缺失、CD7表达缺失是nTFHL-A筛查时最常见的免疫表型异常,而CD10表达较为特异。几乎所有的患者均强表达PD-1和CD45RO。在部分患者中,由于CD3阳性或表达稍弱而CD7阳性或部分表达(组织11.3%、骨髓10.3%),可能造成流式结果假阴性。通过检测滤泡辅助T细胞标记PD-1有助于提高nTFHL-A检出率,同时有助于与其他外周T细胞淋巴瘤作鉴别。结论:流式细胞术是筛查、确定或鉴别nTFHL-A的重要辅助工具。
目的:探究单纯血小板增多型慢性髓细胞性白血病(CML-T)的临床及实验室特征,分析其与原发性血小板增多症(ET)的鉴别要点,为早期鉴别这两类极易混淆的疾病提供思路。方法:对2013年1月至2023年1月我院诊断为CML-T的15例患者进行回顾,对其临床特征及相关实验室结果进行分析;随机选择同时期年龄、性别匹配的ET患者15例,将两种疾病的临床特征及相关实验室结果进行汇总比较。结果:CML-T组呈现明显的血小板计数升高,最高可达2 387×109/L。所有CML-T患者均检测到BCR∷ABL1融合基因,均为p210型。相较ET组,CML-T组外周血具有更多白细胞(WBC)计数、嗜碱性粒细胞比例和更大平均血小板体积(MPV),血涂片出现幼粒细胞的概率更高,骨髓中有核细胞呈现高增生程度的概率更高、具有更高粒红比例、更多巨核细胞数量、更小巨核细胞平均直径及更严重骨髓纤维化程度,P值均小于0.05。结论:当外周血PLT计数增高伴WBC计数增高、嗜碱性粒细胞比例增高、MPV增大及涂片见少量幼粒细胞时,需及时进行BCR∷ABL1融合基因检测,警惕CML-T的可能性。此外,骨髓细胞高增生程度、高粒红比例、巨核细胞数量增多并出现特征性小巨核细胞形态均可提供重要诊断线索,协助临床避免漏诊、误诊,做到早诊、早治。
外周T细胞淋巴瘤(PTCL)是一组异质性肿瘤,来源于成熟T淋巴细胞的肿瘤转化。骨髓及血循环中查见CD3-/dimCD4+异常细胞群与T淋巴细胞肿瘤的诊断及分型价值尚不清楚。收集了67例具有CD3-/dimCD4+异常T细胞群患者的临床最终诊断结果,并比较了患者的血常规、血清生化、免疫球蛋白、炎性因子、残存正常T淋巴细胞亚群等指标,以期探求该异常特征对各类PTCL分型诊断的意义。分析结果表明,骨髓中查见的CD3-/dimCD4+ 细胞均与T淋巴细胞病变相关,其中以血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤最为常见。但在免疫表型上血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)与其他类型T淋巴细胞肿瘤具有交叉,需结合临床特征及病变组织的病理活检进行仔细鉴别。
目的:探讨CD27抗原在多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)患者骨髓瘤细胞上的表达及其临床诊断价值,以及CD27表达水平不同的患者在细胞遗传学异常、免疫细胞分群等方面是否存在差异。方法:检测124名MM患者骨髓瘤细胞的免疫表型,分析异常浆细胞CD27表达水平,以及外周血T 细胞亚群、B细胞亚群与Th1/Th2/Th17细胞亚群表达水平,并检测患者是否存在t(14;16)、p53缺失、del(13q14.3)、IGH重排、t(4;14)、t(11;14)、del(13q14)等细胞遗传学异常。搜集124名患者临床资料,比较CD27+MM患者与CD27-MM患者之间的各项常用临床指标有无明显差异。筛选在院经过4个疗程化疗的57名患者进行疗效评价,分析CD27+MM患者与CD27-MM患者疗效评价有无差别,并对在院内接受治疗的所有患者随访,进行生存分析。结果:124名MM患者中,异常浆细胞CD27阳性率为29.03%(36/124)。对124名MM患者的临床基线资料进行分析,发现CD27+MM与CD27-MM患者淋巴细胞数、血肌酐、乳酸脱氢酶(LDH)、β2-微球蛋白水平有统计学差异。同时,两组患者的细胞遗传学结果显示,CD27+MM患者的IGH重排发生率(31.58%)小于CD27-MM患者(53.41%)。CD27+MM患者的R-ISS分层较CD27-MM患者整体偏低。免疫细胞分群结果显示,CD27+MM患者淋巴细胞B亚群中的CD19+B细胞水平较CD27-MM患者低,而淋巴细胞Th1/Th2/Th17亚群中的TNF-α水平与T亚群中的CD3+CD4+水平较CD27-MM患者高。CD27+MM患者经过4个疗程化疗后,完全缓解+非常好的部分缓解(CR+VGPR)率较CD27-MM患者高,且整体无进展生存时间(PFS)较长。结论:MM患者异常浆细胞上CD27低表达可能与患者疾病进展及预后不良有关。
目的:探讨程序性死亡分子1配体-1(programmed death 1 ligand 1,PD-L1)表达水平在急性髓系白血病发生及转化过程、治疗中的临床意义。方法:(1)利用GEO软件和GEO2R计算方法,以P<0.05、|logFC| >1为条件,分析公共数据库常见免疫检查点的表达情况;使用TCGA-LAML队列数据,利用Survival R包进行高表达PD-L1患者生存分析。(2)选取2017年10月至2023年3月在天津医科大学第二医院血液科确诊为急性髓系白血病的初治患者验证该结论,流式细胞术检测治疗前骨髓T细胞程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)、CD34+原始细胞中PD-L1的表达水平,分析PD-1及PD-L1表达水平与患者临床特征、疗效及生存的相关性。结果:(1)急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)初诊患者中免疫检查点淋巴细胞活化基因3(lymphocyte lctivation gene 3,LAG3)、PD-1、PD-L1和T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3,TIM3)表达较正常人高(P<0.05),初诊时PD-L1低表达组生存率高。(2)复发难治AML、继发性AML初诊时PD-L1表达水平更高,初诊AML患者PD-L1的高表达有复杂染色体核型、预后更差及生存更短的趋势。结论:PD-1/PD-L1信号通路可能参与髓系肿瘤细胞的免疫逃逸机制,其表达水平高与疾病恶性程度、进展呈正相关,与疗效和生存期呈负相关。
目的:探讨流式细胞术(flow cytometry,FCM)免疫表型分析在多发性骨髓瘤(MM)诊疗中的临床意义。方法:选取2019年1月至2023年6月宁夏医科大学总医院血液内科收治的117例初发确诊MM患者,采用流式细胞仪多色荧光标记抗体进行免疫表型分析检测,并同时收集患者骨髓细胞形态学、免疫固定电泳(IFE)、免疫球蛋白定量检测结果分析。结果:117例MM患者经CD45/SSC与CD45/CD38点图设门分析,CD45阴性或弱阳、CD38强阳且SSC较有核红细胞大的分布区域可见异常细胞群体,约占有核细胞比例为0.1%~91.5%,117例均强表达CD38、111例表达CD138、78例表达CD56、67例表达CD229、48例表达CD27、44例表达CD200、40例表达CD117、30例表达CD269、25例表达CD28、19例表达CD20、9例表达CD81、7例表达CD13、4例表达CD19,阳性表达率分别为100%、94.87%、66.67%、57.26%、41.03%、37.61%、34.19%、25.64%、21.37%、16.24%、7.69%、5.98%、3.42%,117例全部均为限制性表达胞质轻链(100%),其中64例限制性表达cKappa轻链(54.70%)、53例限制性表达cLambda轻链(45.30%)。骨髓细胞形态学检查111例镜下形态分类可见骨髓瘤细胞(94.87%),血清IFE检测114例检出M蛋白,M蛋白检出率为97.44%。结论:FCM免疫表型分型能准确、快速、客观的鉴别出良恶性浆细胞,揭示胞质轻链克隆性表达情况及骨髓瘤细胞CD分子的表达特征,为MM早期诊断、分型及预后评估和治疗提供客观依据,具有较好的临床应用价值。
目的:探究成人急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患者骨髓肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及其在患者化疗效果及肿瘤复发评估中的作用。方法:前瞻性地收集了107名B-ALL患者(疾病组)、25名健康供者(健康对照组)和77名其他类型血液肿瘤患者(疾病对照组)的外周血和骨髓血浆样本。通过化学发光免疫分析法测定血浆TNF-α浓度;流式细胞术测定缓解和复发患者白血病细胞半乳糖凝集素-9(Gal-9)表达情况;TNF-α与患者原代细胞体外共培养,检测Gal-9表达情况。结果:B-ALL患者骨髓TNF-α水平升高且TNF-α水平与首次化疗缓解情况有关,首次化疗完全缓解者初诊时的骨髓TNF-α浓度较非完全缓解者更低;复发患者白血病细胞Gal-9表达显著上调;TNF-α在体外可诱导Gal-9表达上调。结论:揭示了成人B-ALL患者骨髓及外周血TNF-α水平升高,并诱导白血病细胞Gal-9表达上调促进疾病进展和复发。
目的:世界卫生组织(WHO)2022年修订的骨髓增生异常肿瘤分类定义了新的慢性粒-单核细胞白血病(CMML)和骨髓增生异常肿瘤(MDS)诊断标准,探讨属于这些类别的CMML和MDS患者的临床和分子特征。方法:对52例外周血单核细胞绝对计数(AMC)增多伴骨髓病态造血患者按照新标准进行诊断修订并与48例非AMC 增多MDS(非MDS-Mo)患者进行比较;回顾性分析不同诊断患者临床特征及预后差别。结果:52例AMC增多伴病态造血者,既往诊断为CMML 35例,其中3例(8.6%)因伴有NPM1突变而修订为急性髓系白血病(AML);既往诊断MDS伴AMC增多17例,其中4例(23.53%)修订为CMML。CMML患者中,AMC≥1.0×109/L(32例)与AMC <1.0×109/L(4例)相比,临床特征及预后均无差异。MDS伴单核细胞增多 (MDS-Mo)组与CMML组(AMC<1.0×109/L),驱动基因突变频率存在差异。而MDS-Mo组较非MDS-Mo组,TP53突变及-5/5q-、-7/7q-的染色体核型更多见,前者中位生存期明显缩短(3.85年 vs 19.43年)。结论:遵守2022年WHO标准可以更好的区分CMML和AML及MDS,MDS-Mo患者存在特征性分子突变及遗传学特征,预后较CMML及非MDS-Mo差,建议作为MDS独立亚型。
目的:分析健康人T细胞各亚群TRBC1和TCR Vβ家族的表达,比较两种流式细胞仪检测T细胞克隆的方法及其判定标准。方法:收集40例健康志愿者外周血,分别对全部CD3+和去除TCR γδ+细胞后的CD3+TCR γδ-T细胞设门,每群T细胞分为CD7+CD5+(T1)、CD7+CD5dim+(T2)、CD7+CD5dim2+(T3)、CD7+CD5-(T4)和CD7-CD5+(T5)5个亚群,分析亚群中CD4、CD8、TCR Vβ家族和TRBC1的表达。结果:39例纳入统计分析,CD3+细胞中,T1、T2、T3、T4和T5的平均比例分别为57.29%、27.74%、5.15%、1.43%和5.99%;T1和T5以CD4+细胞为主,T2、T3和T4以CD8+细胞为主;CD3+中T2、T3和T4亚群中TRBC1+%均明显低于CD3+TCR γδ-T门内相应值(P<0.01)。21例健康人22个亚群中出现TRBC1+%异常(<15%或>85%),主要见于T3和T4亚群;部分亚群可见单个优势Vβ表位,以优势Vβ表位占比≥60%或Vβ总和占比<15%作为判定异常克隆的标准;同时将TRBC1克隆性诊断标准修订为TRBC1+% <12%或>82%后,TRBC1和TCR Vβ两种方法判断克隆性的一致性为96.77%(180/186)。将TCR γδ+细胞影响去除后,分布趋势不变。最终确定的单克隆T细胞发生率为38.46%(15/39),86.67%(13例)克隆性T细胞在淋巴细胞中的比例均低于5%,考虑为生理性克隆性增生;另外2例在淋巴细胞中分别占6.76%和33.24%,可能为意义未明的T细胞克隆(T-cell clones of uncertain signifificance,T-CUS)和T细胞增殖性疾病。结论:健康人利用CD7/CD5分群后在CD5dim+或CD5-亚群内可出现较多的生理性克隆性T细胞,对克隆性T细胞的解释必须与临床密切结合。
目的:建立Logistic回归模型,用于鉴别缺铁性贫血和地中海贫血,并评价和验证模型的有效性。方法:收集2021~2022年昆明医科大学第一附属医院确诊缺铁性贫血和地中海贫血各121例患者资料,随机每组抽取100个病例样本数据为实验组,剩余21个样本数据为验证组。经单因素分析,确定具有统计学差异的变量,并将其纳入多因素分析,可得性别、Hb、MCHC和RDW-SD 4个变量为独立影响因素,并用这4个变量建立Logistic回归模型,以受试者操作特征(ROC)曲线下面积、灵敏度、特异度三个指标评估模型鉴别诊断效果。结果:单因素变量分析显示,RBC、Hb、HCT、MCV、MCH和MCHC值,缺铁性贫血组均低于地中海贫血组,RDW-SD值缺铁性贫血组高于地中海贫血组,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。将性别、Hb、MCH、MCHC和RDW-SD带入二元Logistic回归分析,结果显示,RDW-SD值越高患缺铁性贫血的风险越高,Hb和MCHC下降越明显患缺铁性贫血的风险越高(P<0.05)。Logistic回归模型为:Logit(P)=-19.288-1.685X1+0.035X2+0.066X3-0.076X4。实验组的Logistic模型ROC曲线下面积为0.947,灵敏度为90%,特异度为91%;验证组的灵敏度和特异度分别为100%和72.4%。结论:基于Logistic回归的数学模型在缺铁性贫血和地中海贫血的鉴别诊断中有一定临床应用价值。
目的:探讨脑脊液中总蛋白与细胞因子水平对中枢神经系统淋巴瘤(central nervous system lymphoma,CNSL)的诊断价值及对预后的影响。方法:收集2021年10月至2023年2月在重庆大学附属肿瘤医院行脑脊液检测的患者43例,其中诊断为CNSL的患者18例,为CNSL组,临床存在淋巴瘤中枢侵犯高风险因素但未发生淋巴瘤中枢侵犯的患者25例,为对照组。收集患者临床基本信息、脑脊液生化指标检测及脑脊液细胞因子检测的结果,分析脑脊液相关指标对患者预后的影响。结果:CNSL组患者的脑脊液总蛋白及细胞因子TNF-α、TNF-β、IL-17A、IL-6、IL-10的表达水平显著高于对照组(P<0.05)。脑脊液总蛋白联合细胞因子TNF-α、TNF-β、IL-17A、IL-6、IL-10检测诊断CNSL的曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.957,灵敏度为94.1%,特异度为95.5%,显著高于总蛋白单项指标和仅脑脊液细胞因子联合的诊断价值(P<0.05)。CNSL组和对照组的2年总生存率分别为29.1%、56.0%,2年无进展生存率分别为23.1%、68.0%。CNSL组患者中位无进展生存期更短(P=0.03),两组的中位总生存期无统计学意义(P=0.11)。脑脊液总蛋白高水平,细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10高表达,以及IL-17A和TNF-β低表达患者的无进展生存期和总生存期更短,但差异无显著统计学意义(P>0.05)。结论:CNSL患者预后较淋巴瘤中枢转移高风险患者预后更差,脑脊液总蛋白联合细胞因子TNF-α、TNF-β、IL-17A、IL-6、IL-10的表达水平能辅助诊断CNSL,其表达水平对CNSL患者预后具有一定影响。
目的:探讨免疫性血小板减少症(ITP)患儿外周血免疫细胞绝对计数水平的变化及临床意义。方法:选取2022年1月至2023年8月宁夏医科大学总医院儿三科收治的初诊ITP患儿41例作为病例组,同期30例健康儿童为对照组,采用流式细胞术检测并比较两组外周血中CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T细胞、CD3-CD19+B细胞和CD3-CD16+CD56+NK细胞绝对计数水平和百分比水平及CD4+/CD8+值。结果:相较对照组,病例组患儿CD3+、CD3+CD4+T细胞绝对计数水平及CD3-CD19+B细胞绝对计数及百分比水平明显升高(P<0.05)。CD3-CD16+CD56+NK细胞百分比降低(P<0.05)。CD8+T细胞绝对计数水平、CD3+、CD4+、CD8+T细胞百分比、CD4+/CD8+值差异及CD3-CD16+CD56+NK细胞绝对计数差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:ITP患儿外周血免疫细胞存在紊乱现象,绝对计数水平能客观真实反映患儿体内免疫细胞的变化情况。判读免疫细胞水平的异常变化应以绝对计数为基础来分析百分比水平的变化,从而更好地为临床疾病诊疗提供帮助。
目的:探讨IL-17A诱导后的衰老内皮细胞中差异基因表达,以及IL-17A诱导内皮细胞衰老的可能作用机制。方法:对未经刺激的人脐静脉上皮细胞(HUVEC)和IL-17A刺激后的HUVEC进行衰老指标检测和RNA-seq测序,对差异基因进行KEGG富集分析,筛选差异基因进行qRT-PCR验证。结果:与未经刺激的HUVEC相比,IL-17A刺激后的HUVEC发生细胞衰老;进行聚类分析后,选取SMAD6进行qRT-PCR验证,分析结果与测序结果趋势相符。结论:IL-17A可以激活或抑制一些与衰老相关的基因和通路导致内皮细胞衰老。
目的:建立一种检测低水平JAK2V617F突变的微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)方法并探讨其在骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasm,MPN)中的应用价值。方法:利用位点特异性的TaqMan-MGB探针,建立用于检测基因组DNA中JAK2V617F突变的ddPCR方法,应用该方法、实时定量PCR及二代测序方法检测MPN患者JAK2V617F突变,比较不同方法检测结果的一致性。结果:成功建立了一种基于特异性TaqMan-MGB探针检测JAK2V617F突变的ddPCR方法,检测灵敏度至少为0.05%。应用ddPCR方法及实时定量PCR方法对82份MPN患者及8份健康对照者的骨髓或外周血DNA样本同时进行检测,其中87份样本检测结果一致,检出的一致率为96.7%;3份经实时定量PCR方法检测为阴性而ddPCR检测为阳性的样本,ddPCR的定量结果分别为0.015%、0.002%、0.039%,均低于实时定量PCR的检出下限;对于两种方法检测结果均为阳性的52份样本,其定量数据的相关系数为0.971 4(P<0.000 1)。11例样本同时采用二代测序的方法进行验证,两者定量结果的相关系数为0.983 9(P<0.000 1)。结论:利用特异性TaqMan-MGB探针检测JAK2V617F突变的微滴式数字PCR方法可便捷、准确地检测JAK2V617F突变,该方法具有高度的灵敏度且可绝对定量,在JAK2V617F突变的筛查及动态监测中具有潜在应用价值。
目的:探讨重型再生障碍性贫血(severe aplastic anemia,SAA)小鼠模型中淋巴细胞功能亚群和巨噬细胞亚型的特点。方法:B6D2F1小鼠经过全身照射(total body irradation,TBI)后,接受C57BL/6小鼠的淋巴细胞输注,建立SAA小鼠模型;以仅接受TBI的B6D2F1小鼠为对照组。在造模成功后收集两组小鼠外周血、淋巴结、脾脏和骨髓,通过流式细胞术检测小鼠T淋巴细胞亚群及CD4+和CD8+细胞表型分化情况;流式细胞术和免疫组化观察小鼠骨髓中巨噬细胞比例及其极化状态。结果:与TBI对照组相比,SAA组小鼠在造模的第12~13天出现严重骨髓衰竭,表现为骨髓造血面积明显减少,外周血白细胞、血红蛋白和血小板均显著下降。SAA组小鼠淋巴结、脾脏和外周血中CD8+淋巴细胞比例升高,CD4+/CD8+淋巴细胞比值显著下降。SAA小鼠的CD4+和CD8+淋巴细胞中,CD44+CD62L-效应记忆T细胞增多,而CD44-CD62L+的初始 T细胞和CD44+CD62L+中央记忆T细胞比例显著下降。SAA小鼠骨髓中CD11b+F4/80+巨噬细胞增多,且巨噬细胞以CD86-cCD206+和iNOS-cCD206+的M2型巨噬细胞为主。结论:SAA小鼠模型中,CD4+/CD8+淋巴细胞比值显著下降,淋巴细胞主要为表达CD44+CD62L-的效应记忆T细胞;骨髓巨噬细胞增多,且以M2型巨噬细胞为主。
随着流式细胞检测技术的发展,仪器检测灵敏度、精度与稳定性不断提升。藻红蛋白 (phycoerythrin, PE) 荧光标记蛋白的定量检测结果已得到普遍认可。越来越多的研究提示测定样品单细胞表面蛋白的定量有明确临床意义,流式蛋白定量检测的需求正在增加,但是常用的BD QuantibriteTM Beads PE 荧光定量方法局限于PE定量标准品,仅能使用PE荧光抗体,无法适应目前多色流式检测的需要。介绍了在多色流式检测中使用系列抗体定量捕获微球QuantumTM Simply Cellular? 微球(QSC微球)进行单细胞表面多重蛋白定量的方法。QSC 微球最初设计用于细胞表面蛋白定量,但因为其定量结果不稳定且与经典方法差距巨大,无法实际应用。通过比对多种实验条件探索解释并克服QSC微球蛋白定量技术的缺陷。介绍了改进后的多色流式细胞表面蛋白定量方法并展示了新方法获得的人淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、 CD45RA、CD127和CD197蛋白的定量数据,尽管这一技术还有待优化,但其应用前景广阔,可以使多色流式获得跨平台可比较的单细胞多重蛋白表达数据,可以为单细胞多组学研究提供蛋白质指标间的量化关系数据,并且可用于自动荧光补偿计算、荧光溢漏扩散计算、抗体质量监测、多色荧光方案设计等。
目的:构建稳定敲低TET2基因的SKM-1细胞株,将包装好的H_TET2-shRNA慢病毒感染SKM-1细胞株,得到H_TET2-shRNA SKM-1稳定株。方法:将稳定敲低的SKM-1细胞株进行qPCR和Western blot实验验证。利用CCK-8细胞活力检测试剂盒和流式细胞术分别检测转染前后SKM-1细胞的增殖活性和凋亡情况。结果:qPCR验证H_TET2-shRNA的SKM-1细胞中TET2基因表达量明显降低;Western blot表明H_TET2-shRNA的SKM-1细胞中TET2蛋白表达量也明显降低;利用CCK-8细胞活力检测证实了TET2基因稳定敲低后并不影响细胞的活力;细胞周期检测发现敲低TET2后S期细胞占总细胞数的48.1%,高于SKM-1组(42.3%)和对照空质粒组;细胞凋亡检测发现TET2敲低组SKM-1细胞凋亡率为0.6%,低于空质粒组的4.4%。结论:通过慢病毒介导构建TET2基因稳定低表达的SKM-1细胞株,利用PCR、Western blot实验验证成功构建细胞株,利用CCK-8细胞活力检测证实TET2基因稳定敲低后并不影响细胞活力;流式细胞术细胞周期检测发现TET2基因敲低会影响细胞DNA复制功能,导致细胞间期分裂异常,影响细胞生长和自我修复;流式细胞术细胞凋亡检测发现TET2基因敲低会抑制细胞凋亡,这可能与TET2是抑癌基因相关。
目的:探讨免疫性不孕患者与健康女性之间细胞因子的差异,以及细胞因子水平与免疫性不孕患者治疗效果的关系。方法:96例女性免疫性不孕患者和57例健康女性分别作为实验组和对照组纳入研究,通过流式细胞术检测了7种细胞因子的水平,并进行了为期2年的生育状况追踪。结果:实验组和对照组血清中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ等6种细胞因子水平存在显著差异(P<0.05),实验组中治疗效果不佳的非妊娠组IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-17A水平均高于妊娠组(P<0.05)。基于细胞因子数据和患者的生育结局,以PyCaret库成功构建了一种新的免疫性不孕治疗效果预测模型。经评估,装袋二次判别分析(Bagging QDA)模型在训练集上表现最佳,测试集上的灵敏度为72.73%,特异度为81.25%,准确度为72.41%。结论:免疫性不孕及其治疗效果均与Th1/Th2细胞因子异常相关,而Bagging QDA模型在预测免疫性不孕的预后方面具有较高准确性。
