目的: 观察MUC1对人结肠癌细胞HCT116增殖、侵袭及化疗敏感性的影响。方法:采用MUC1表达阴性的结肠癌细胞株HCT116,通过慢病毒转染、嘌呤霉素筛选、半定量RT-PCR和Western blot鉴定构建稳定表达MUC1的HCT116细胞株;实验分空病毒组和MUC1病毒组;CCK实验和软琼脂克隆形成实验检测两组细胞的增殖能力,Transwell侵袭实验检测两组细胞的侵袭能力;MTT法和流式细胞仪检测两组细胞对奥沙利铂的敏感性,酶底物法检测Caspase-3活性。结果: 获得稳定表达MUC1的HCT116细胞株;两组细胞贴壁生长无差异;与空病毒组相比,MUC1病毒组细胞软克隆形成数增加,穿过小室的细胞数增加(P<0.05);MUC1病毒组细胞对奥沙利铂的敏感性降低,MUC1病毒组Caspase-3活性水平低于空病毒组(P<0.05)。结论: MUC1与结肠癌的非锚定依赖生长、侵袭和化疗敏感性有关。
目的:构建p1301-YO-K2-YO双油体KGF-2融合蛋白表达载体并转化拟南芥,与p1301-YO-K2单油体KGF-2融合蛋白表达载体对比,观察是否能够提高外源蛋白KGF-2的表达量,并对融合蛋白生物学活性进行鉴定。方法:PCR获得拟南芥油体蛋白oleosin和KGF-2核心区基因片段,融合PCR获得 KGF-2-oleosin 融合基因,与包含有一个oleosin的p1301-oleosin载体连接,构建p1301-YO-K2-YO(oleosin-KGF-2-oleosin)表达载体,利用农杆菌介导法将其转入拟南芥中进行表达,除草剂筛选获得转基因植株,通过PCR鉴定、SDS-PAGE、Western blot对KGF-2蛋白表达进行分析,提取油体蛋白涂抹法观察对C57BL/6小鼠的毛囊促生长作用。结果:双油体载体成功转入拟南芥基因组中;Western blot灰度分析可知,与单油体表达载体p1301-YO-K2相比,双油体融合表达策略可使KGF-2蛋白表达量提高2.5倍左右;动物实验结果表明油体融合蛋白具有良好的促毛囊增殖活性。
非生物胁迫造成植物胞内产生大量活性氧ROS和自由基,导致植物细胞结构及酶系统受到破坏。类胡萝卜素是植物胞内重要的抗氧化物质,与植物的抗氧化功能有重要关系。为了提高洋桔梗的抗氧化性,将来自枸杞(Lycium Chinense Miller)的β-类胡萝卜素羟化酶基因(LcCHYB)导入洋桔梗中,研究结果表明以10%过氧化氢胁迫洋桔梗叶片20 min后,转基因洋桔梗叶片中总类胡萝卜素、玉米黄质含量及叶黄素循环池容量显著提高,同时对光合荧光参数和抗氧化酶系统的酶活性也进行探讨,发现转基因洋桔梗相对于野生型植株对氧化胁迫的耐受性也有了显著的提高。
目的:研究向日葵盐胁迫前后基因表达的变化,分离并鉴定耐盐相关基因。方法:采用cDNA-AFLP技术分析盐胁迫产生的差异表达基因片段。结果:从256对引物组合中筛选到232对有差异表达的引物组合。用其进行选择性扩增,获得差异表达的上调TDFs 845条。经二次PCR扩增及反向Northern blot验证,获得42个阳性TDFs。对其中12个TDFs进行克隆及序列测定,得到10条TDFs核苷酸序列。经Blastx比对及功能分析,10个TDFs均与应答盐胁迫相关,涉及信号转导相关蛋白、胁迫相关功能蛋白、衰老相关蛋白以及与蛋白相互作用有关的蛋白。结论:利用cDNA-AFLP技术鉴定出一批盐胁迫应答基因,为揭示向日葵耐盐分子机制及指导向日葵耐盐分子育种实践奠定基础。
通过采集自湖北荆州地区的三种不同表现型的半夏属植物的叶片组织中提取基因组,纯化后经直接PCR扩增得到其对应的ITS序列并测序。运用NCBI GenBank数据库进行序列比对与进化树分析。根据比对与分析结果,结合植物形态学特征显示,HBB-01为Pinellia ternata, 为《中国药典》中规定的半夏类药材品种;HBD-02为P. tripartita,为药用半夏的混淆品;HBF-03的结果较为复杂,其不仅与芋属(Colocasia)天南星属(Arisaema)、半夏属(Pinellia)等植物ITS序列的同源性高达80%以上,而且在进化关系上,它们也有一定关联。所以推测HBF-03可能为天南星科不同属但亲缘关系较近的植物产生的变种,具体种属来源有待进一步论证。通过三种半夏种属来源及其亲缘关系的分析,鉴定了荆州地区的半夏人工种植的主要品种,对其当地药农种植符合《中国药典》规范的半夏药材具有指导意义,为后续优质半夏资源的保护与选育提供了参考依据。
目的:建立基于显微形态标记及流式分选分离大鼠心脏Telocytes(CTs)的方法。方法:采用抗体c-Kit免疫磁珠法获得原代心脏Telocytes,显微注射DiI标记具"Telopode"典型形态的细胞,使用流式分离及回收单个DiI+细胞;使用免疫荧光技术和RT-PCR方法对经回收的单个细胞来源的细胞进行表型鉴定。结果:显微注射DiI能较好地标记具Telocytes典型形态的细胞,结合流式分选及单细胞回收,能有效回收经标记的DiI+细胞,经回收的DiI标记阳性Telocytes的贴壁率为14.9%,增殖率为5.6%,呈克隆样生长率为2.4%,该呈克隆样生长的细胞能通过消化传代。免疫荧光染色证明,该回收Telocytes表达其相对特异性表面标记物c-Kit和CD34,RT-PCR的结果也证明:经回收Telocytes表达其相对特异基因 c-Kit、CD34、Vimentin和PDGFR-β 。结论:研究所建立的方法能有效分离及单细胞回收高纯度的心脏Telocytes,经回收的心脏Telocytes具有增殖及传代能力,且能维持其特异表型。
为探讨适配体介导的脂质体靶向递送siRNA的可行性,采用前列腺癌细胞膜表面抗原(PSMA)的适配体A10-3.2与脂质体结合,构建适配体-脂质体靶向递送体系(Apt -LP),并利用Apt-LP递送pEGFP-N1质粒和Bcl2 siRNA到前列腺癌细胞LNCaP(PSMA+)和PC-3(PSMA-),转染48h后,用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达,qPCR检测 Bcl2 mRNA表达,蛋白印记法检测Bcl2蛋白表达,Hoechst 33258核染法分析体外抗肿瘤活性。结果显示:与脂质体递送体系相比,Apt-LP显著提高递送pEGFP-N1质粒和Bcl2 siRNA到靶细胞LNCaP(PSMA+)的效率;显著提高Bcl2 siRNA 诱导的靶细胞LNCaP(PSMA+) Bcl2 基因沉默效应,更有效的诱导靶细胞LNCaP(PSMA+)凋亡。结果表明:Apt -LP是一种有效的siRNA靶向递送体系,具有潜在的临床应用价值。
生物医药领域中一套高效表达系统对于重组蛋白的生产至关重要。酿酒酵母作为一种食品级真核微生物,具有繁殖迅速、培养简单、遗传操作便捷等特点,是生产重组蛋白较理想的表达系统之一。对实验室已有的pHR酿酒酵母表达系统进行优化。分别通过易错PCR技术和菌株诱变技术对酿酒酵母启动子PTEF和宿主酿酒酵母Y16进行突变改造,经筛选、鉴定获得表达性能提高的启动子PTEFV1和酿酒酵母Y16-E14、Y16-E19。随后,利用启动子PTEFV1构建以Y16-E14为宿主的pHR-N酿酒酵母表达系统,以绿色荧光蛋白和人血清白蛋白为对象,比较表达系统改造前后性能变化。结果显示pHR-N酿酒酵母表达系统无论胞内表达绿色荧光蛋白还是分泌表达人血清白蛋白的能力均较改造前明显提高。pHR-N系统为获得更多具有重要应用价值的重组蛋白提供了有利的工具。
目的:以Streptomyces lividans TK24为表达宿主,构建高效表达棘白霉素脱酰酶(EchDA)的基因工程菌。方法:从Actinoplanesutahensis NRRL 12052中获取EchDA的基因片段,连接到链霉菌表达载体pNW-S1,采用诱导型启动子Plac与组成型启动子PermE*和PSau3A,依次构建基因工程菌株ZNW-S11、ZNW-S12和ZNW-S13。通过分析启动子对EchDA分泌表达的影响,确定工程菌的表达能力,随后完善发酵放大的工艺过程,将工程菌株发酵放大到300 L发酵罐水平。结果:成功实现了EchDA在S.lividans TK24中的诱导分泌表达;在摇瓶水平,EchDA的酶活可达到125U/L,在24h内可实现对15g/L米卡芬净前体FR901379的完全转化;在300L发酵罐水平,EchDA的酶活可达到80U/L,可用于10g/LFR901379的完全转化。当前,国内在工业生产中仍使用原始菌A. utahensis来表达EchDA,而开发的EchDA基因工程菌,与之相比在生产效率上有了大幅度提升,有助于改良当前棘白霉素类抗生素的生产工艺。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)通过转录后基因沉默效应特异性抑制靶基因的表达,其沉默机制的高效性、特异性及稳定性使这项技术成为生物医学领域研究基因治疗的重要工具。阐述RNAi技术的特点和RNAi疗法的现状,特别是多靶小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)目前的发展态势及其各种结构性修饰,通过使用这些结构修饰的siRNA提高基因沉默的效率,将有助于提高疗效。但该技术在广泛应用于临床之前,仍存在一些亟待解决的问题与面临的挑战,需进一步研究。
近年来,生物催化为化学、生物学和生物工程学等领域提供了一种绿色研究工具,其中多酶体系在这些领域中的应用越来越受到关注,其克服了以往单个酶不能满足催化需求的局限性,同时多酶共固定化在级联反应过程中,可增加酶周围的反应物浓度,并将不同酶的催化特性结合起来,能排除干扰因素,从而提高酶的整体催化效率。对多酶共固定化反应体系的研究进展进行了综述,包括多酶反应体系的类别、共固定化技术的特点以及相关应用,并对共固定化多酶反应体系进行了展望。
随着工农业的发展,土壤重金属污染日益加剧,严重威胁着粮食生产和人类健康。植物修复因其成本低、环境友好以及可大规模原位修复等优点备受关注,成为近年来迅速发展的重金属污染土壤治理技术。在介绍国内外植物修复技术发展与应用现状的基础上,提倡大力发展能源植物修复重金属污染土地,并结合湖南重金属污染田间试验结果,重点对甜高粱(Sorghum bicolor (Linn.) Moench)用于重金属污染土壤修复的优势、可行性及提高修复效率的措施进行了深入分析与探讨。利用甜高粱治理土壤重金属污染,能将土壤修复与生物能源生产有机结合,使重金属从粮食链转入能源链,同时兼顾了生态和经济效益,具有广阔的应用前景。
甲壳素脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA, E.C.3.5.1.41)是一种能催化脱去甲壳素分子中N-乙酰葡糖胺链上的乙酰基,使之变成壳聚糖的酶。而壳聚糖因其独特的性质被广泛应用于医药、食品、化工、化妆品等行业。对CDA的来源、分离纯化和酶学性质、结构和催化机制、基因的克隆表达及应用前景等方面的研究进行了综述,并分析出今后的主要研究方向应在CDA基因的克隆表达、CDA底物的改造及CDA的结构和催化机制等方面。
透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的双糖单位聚合而成的直链酸性黏多糖,已被广泛应用于药物、化妆品和食品添加剂。微生物发酵法是目前生产透明质酸最有效的方法。生物体内透明质酸的合成途径基本一致,均为Leloir途径。透明质酸合成操纵子由透明质酸合酶基因、尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因组成,其表达受CovS/CovR和LuxS等多种调控系统调控。随着分子生物学技术的迅速发展以及对透明质酸合成相关基因了解的不断深入,人们从提高透明质酸安全性、提高透明质酸产量和调控透明质酸分子质量三个方面出发,通过基因工程手段构建出了高产、安全、一定分子质量范围的透明质酸生产菌株。就有关透明质酸生物合成途径、合成相关基因表达调控及生产菌株分子生物学改造的策略与研究进展进行综述和展望。
目的:基于市场角度分析生物技术药物发展现状和未来趋势。方法:检索Thomson Reuters Cortellis数据库、全球医药市场研究机构EvaluatePharma和美国食品药品监督管理局公布的数据,利用对比分析方法对检索结果进行分析。结果:得益于生物技术药物本身的优势特点,全球生物技术药物市场比例将由2013年的22%增长至2020年的27%,2020年全球市场中罗氏仍然保持最大的市场份额,市场销售额将达435亿美元。尽管中国生物技术药物的市场总额占全球市场的比例仅为2%,但未来发展空间较大,且目前已经形成了以国药集团为龙头的产业集群。结论:随着疾病治疗需求的增加,生物技术药物发展潜力巨大,未来市场将进一步扩大。
