2013年, 第33卷, 第7期　
刊出日期：2013-07-25

  

• 全选
  |

研究报告
• Select
  高表达Snail蛋白诱导黑色素瘤EMT细胞模型的构建及鉴定

  方瑞, 郭强, 杜军

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 1-7.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  目的:构建稳定表达Snail蛋白的可用于肿瘤上皮-间质化研究的肿瘤细胞模型。方法:采用亚克隆方法从质粒pCMV6-mSnail中PCR扩增小鼠Snail基因,连接至表达质粒pL-tdTomato-Neo,筛选重组质粒并经双酶切及测序鉴定。构建成功的重组质粒pL-tdTomato-mSnail转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选稳定细胞株。采用荧光定量PCR和Western blot技术检测胞内Snail及上皮/间质标志物的变化。建立裸小鼠皮下移植瘤模型,活体成像系统观测移植瘤。结果:重组质粒pL-tdTomato-mSnail成功构建,其稳定转染株B16/dT-mSN胞体发出强烈红色荧光。胞内Snaill水平显著上调,E-钙粘蛋白下调,波形蛋白表达上调,呈现典型的上皮-间质化表型。结论:成功获得稳定高表达小鼠Snail蛋白的EMT细胞模型,且可用于体内外荧光成像观测,为研究Snail蛋白在介导肿瘤EMT过程中的生物作用提供了重要的实验工具。
• Select
  集成干扰素突变体IIFN/165S的构建及其生物学评价

  田硕, 姚文兵, 徐晨

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 8-12.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  目的:通过定点突变,构建集成干扰素(IIFN/165S),以期获得高效的新型药物分子。方法:采用 PCR体外定点突变技术,使集成干扰素IIFN基因的第165位密码子由CGT突变为AGT。扩增片段克隆入 pET-23b 表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。在LB培养基中培养,经IPTG诱导表达的IIFN/165S 经包涵体变性、复性以及层析纯化后,经SDS-PAGE、Western blot 和MALDI-TOF-MS分析,用WISH-VSV系统进行抗病毒活性测定同时应用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:IIFN/165S 以包涵体形式表达。纯化后,IIFN/165S的纯度大于95%,分子量为18172,比活性 (7.63±0.22)×10⁸ IU/mg,诱导细胞凋亡率呈剂量依赖。结 论:构建了IIFN/165S的表达载体,并成功地在大肠杆菌中表达,获得了高纯度高活性突变分子IIFN/165S。
• Select
  FrzA基因转导干预缺血性心力衰竭小鼠心肌Wnt信号通路的研究

  沈鑫, 马依彤, 杨毅宁, 刘芬, 于子翔, 陈邦党, 陈铀

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 13-17.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  目的:研究重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 9,rAAV9)携带FrzA基因转导干预缺血性心衰小鼠心肌Wnt信号通路的可行性,为基因治疗心力衰竭提供新的思路。方法:选择3月龄雄性C57BL/6J小鼠共130只,随机分为空白组(n=10),心衰组(n=40),心衰+空病毒(rAAV9-GFP)注射组(n=40),心衰+rAAV9-FrzA组(n=40),采用结扎左冠状动脉定量控制心梗面积,于术后2周行心脏超声评各组心功能变化,再经尾静脉注射已稀释好的病毒,28d后处死小鼠取心脏标本,RT-PCR检测心肌目的基因FrzA以及 Dvl-1,β-catenin的表达;Western blot检测心肌Wnt信号通路关键分子Dvl-1,GSK3β,p-GSK3β,β-catenin的表达。结果: 与空白组相比,成功建立心衰模型后小鼠心功能均不同程度降低(P<0.05);FrzA组与心衰组相比,心功能明显改善(P<0.05);经尾静脉注射可成功将rAAV9-FrzA导入小鼠体内,并且目的基因FrzA在心肌组织中高表达(P<0.05);心衰小鼠心肌中Wnt信号通路关键分子Dvl-1,p-GSK3β,β-catenin的表达显著升高(P<0.05),FrzA转导后小鼠心肌中Wnt信号通路中关键分子Dvl-1,p-GSK3β,β-catenin表达均降低(P<0.05)结论: 利用rAAV9-FrzA转导缺血性心衰小鼠可以有效的干预心肌Wnt信号通路,抑制其活性,为基因治疗缺血性心衰提供了新的思路。
• Select
  产肠毒素大肠杆菌亚单位疫苗3STa^M(G)-K99和3STa^M(S)-K99的纯化及其免疫学性质的研究

  郭乐, 刘昆梅, 李敏, 赵辉, 徐广贤, 段相国, 韩学波, 杨华, 王玉炯

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 18-24.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是一种导致新生犊牛和仔猪腹泻的主要病原体之一。ETEC的毒力因子主要有黏附素(CFs)、不耐热性肠毒素(LT)和耐热性肠毒素(ST)三种。在前期研究中,利用PCR和酶切连接技术成功构建了两种ETEC亚单位疫苗3STa^M(G)-K99和3STa^M(S)-K99,且在大肠杆菌中获得高效表达。本研究利用阴离子交换层析纯化融合蛋白3STa^M(G)-K99 and 3STa^M(S)-K99,辅以弗氏佐剂免疫新西兰大白兔,通过Elisa分析其免疫学性质,并利用肠毒素中和实验在昆明系乳鼠中评价其激发抗STa中和抗体的能力。实验结果表明:亚单位疫苗3STa^M(G)-K99 and 3STa^M(S)-K99能够激发相对较高水平、可针 对天然STa、ETEC和融合蛋白STa-K99的特异性抗体。其次,亚单位疫苗中STa突变体(STa^M)组分的肠毒素活性显著降低,且其所激发的特异性抗体属于中和抗体,能有效抑制天然STa的肠毒素活性。亚单位疫苗3STa^M(G)-K99 and 3STa^M(S)-K99为研制预防ETEC感染性腹泻的多价基因工程疫苗提供了基本素材和理论指导。
• Select
  猪链球菌口服疫苗的制备及小鼠血清免疫效果的评价

  张秋香, 侯慧丽, 芦颖, 陈卫, 钟瑾

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 25-30.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  为构建猪链球菌(Streptococcus suis)新型疫苗,给猪链球菌病的防治提供新思路,首先在大肠杆菌中表达猪链球菌毒力因子EF和MRP,以His-tag柱纯化重组蛋白,并制备EF和MRP鼠源多克隆抗体。随后将ef和mrp基因置于组成型启动子P₅₉和信号肽Usp₄₅下,克隆到乳酸菌表达载体pMG36e上,电击转化到干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) ATCC27092中进行表达。Western blot检测显示EF和MRP蛋白均能在乳酸菌中成功表达,且EF蛋白的表达量随着重组菌生长时间的增长而增大,而MRP蛋白的表达量在重组菌生长到OD₆₀₀为0.8时达到最高,随后慢慢下降。用含有表达EF和MRP蛋白的重组干酪乳杆菌喂饲C57BL/6J小鼠,发现重组菌可在小鼠体内存活2d左右,并可有效刺激小鼠产生EF和MRP特异性抗体,为研制乳酸菌口服疫苗防治猪链球菌病的可行性进行了有益的探索。
• Select
  一种新型仿生抗菌剂的功能研究

  赵彪, 高杨, 周华锋, 段明星

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 31-35.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  抗菌剂α-炔丙基-γ-亚甲基-γ-丁内酯是以天然抗菌物质原白头翁素为基础,利用仿生技术合成出的新型抗菌剂。通过悬液杀菌法进行最小抑菌浓度测定、悬液定量法及活体菌落计数法进行最小杀菌浓度测定等生化试验对其抗菌效果进行了检验;通过细胞壁结构的完整性实验及透射电镜观察等理化实验对其抗菌机理做初步研究,为其应用于实践提供依据。抗菌剂α-炔丙基-γ-亚甲基-γ-丁内酯对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及马拉色菌均具有良好的抑菌作用,对马拉色菌的抑菌作用尤为突出,并对其具有良好的杀菌作用。其对马拉色菌的最小抑菌浓度为0.5mg/ml,当其浓度在10mg/ml时,对马拉色菌具有瞬杀作用(作用1min对球形马拉色菌的杀灭率可达到99.99%)。通过胞壁完整性实验以及电镜观察实验表明该抗菌剂的抑菌机制并不是完全破坏胞壁结构,但是对细胞壁有一定影响。
• Select
  粘质沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1基因大肠杆菌优化表达

  苏燕南, 薛正莲, 陈涛, 马琦亚

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 36-42.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  以粘质沙雷氏菌 PL-06 基因组为模板扩增得到磷脂酶A1基因plaA和含有辅助蛋白的磷脂酶A1基因plaB。plaA和plaB基因与pET-28a(+)连接后转入大肠杆菌BL21(DE3)表达,得到基因工程菌AP28和BP28。AP28最佳的诱导表达条件为诱导初始OD₆₀₀值0.5,IPTG浓度为0.2mmol/L,诱导温度为37℃,诱导时间为4h,优化后磷脂酶A1蛋白表达水平从32%上升至46%,包涵体复性的磷脂酶A1酶活从10.8U/ml上升到12U/ml,相对于BP28工程菌,目的蛋白的表达对宿主细胞毒性小,而且得到的蛋白容易纯化。因此通过优化磷脂酶A1基因plaA的诱导条件,使磷脂酶A1以大量的包涵体形式表达,从而得到较高活性的磷脂酶A1并避免其对宿主细胞的毒性是可行的,而且可以得到大量纯化的磷脂酶A1蛋白,方便下一步的研究。
• Select
  麻疯树核糖体失活蛋白Curcin2的原核可溶性表达及其抗真菌活性研究

  邵子静, 蒋楠, 晏华立, 詹诚, 徐莺, 陈放

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 43-49.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  Curcin2是麻疯树幼苗在真菌侵染、干旱及高低温胁迫下诱导产生的一种核糖体失活蛋白。采用分子克隆的方法,从麻疯树基因组中扩增到 Curcin2 成熟肽编码基因,分别连接到质粒载体pGEX-6p-1、pMAL-c5E上,转化大肠杆菌最终获得重组菌PGC(pGEX-6p-1-curcin2)和PMC(pMAL-c5E-curcin2)。在不同温度、IPTG浓度、时间诱导下,Curcin2在重组菌PGC中均以包涵体形式表达,在重组菌PMC中主要以可溶性融合蛋白形式表达,且蛋白质的表达量与诱导条件相关。重组菌PMC表达可溶性curcin2的优化条件为:温度28℃,IPTG 0.3mmol/L,时间8h,此条件下目的蛋白占总蛋白表达量的30.6%, 1L培养物中可获得19.74mg电泳纯的重组蛋白。 重组蛋白可被MBP Trap^TM HP柱亲和纯化并与curcin抗体发生抗原抗体反应。体外抗真菌活性实验表明,纯化后的curcin2融合蛋白有抑制真菌生长作用,且对小麦赤霉、油菜菌核的抑制作用强于curcin。此蛋白的获得为其相关功能的研究奠定了基础。
• Select
  抗菌豆豉发酵菌株的筛选及其脂肽组分鉴定和特性研究

  孙力军, 王雅玲, 刘唤明, 徐德峰, 张永平, 聂芳红

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 50-56.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  目的:从豆豉中分离广谱抗菌活性菌株,并鉴定其发酵产物中的抗菌成分。方法:采用生理生化实验结合16SrRNA序列测定法鉴定目标分离株,通过LC-MS和ESI/CID技术对其抗菌组分进行鉴定。结果:从8个豆豉样品中分离出7株具有抗菌活性菌株,其中抗菌活性较强的分离株NT-6为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其发酵液抗菌提取物的主要成分是抗菌脂肽类物质iturin、fengycin、surfactin同系物的混合物。该提取物对供试革兰氏阳性、阴性细菌、霉菌等指示菌具有广谱的抗菌活性,在pH 2~12、121℃条件下加热30min活性不丧失,说明具有广泛的pH适应范围和良好的耐热性。结论:该菌株产生多组分抗菌脂肽,其抑菌谱宽,适应性好,显示了在食品、农业、医药等领域具有良好的应用前景。
• Select
  三菌混合固态发酵产纤维素酶

  蔡晶晶, 段学辉, 谢亮, 郑希帆, 沈江涛

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 57-63.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  以稻草粉和麸皮为主要原料,对白腐菌(White-rot fungi)NS75、黑曲霉(Aspergillus niger)NS83和絮凝酵母(Saccharomyces cerevisiae)SP5混合菌固态发酵产纤维素酶进行研究。实验结果显示,在白腐菌和黑曲霉双菌混合培养2d后接入絮凝酵母,培养到第7d产酶达到峰值;三菌混合发酵产纤维素酶酶活明显高于白腐菌和黑曲霉双菌混合培养,其β-葡萄糖苷酶(β-G)和羧甲基纤维素酶(CMCase)酶活比白腐菌(White-rot fungi)NS75和黑曲霉(Aspergillus niger)NS83双菌发酵产酶分别提高了143.3%和68.2%。单因素实验和正交实验结果表明,当稻草粉麸皮质量比为8:2,料水比为1:2,白腐菌NS75、黑曲霉NS83和絮凝酵母SP5的接种比例为1:2:1.5(v/v/v)时,于30℃培养7d,固态发酵基中β-G和CMCase酶活分别达到62305U/g和30241U/g。
技术与方法
• Select
  液相杂交快速检测特异DNA

  詹诚, 毛强, 王胜华, 陈放

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 64-70.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  检测特异DNA片段的方法中,传统Southern blot技术由于其高度可重复性及能够显示条带大小的特性,一直是DNA检测的"黄金标准"。但是杂交时间长,步骤复杂,放射性污染等问题亟待解决。为了简化Southern blot,研究使用了一种液相杂交快速检测DNA的方法,即使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的dUTP掺入探针后,在溶液中与待检测DNA样本42℃下杂交,然后琼脂糖凝胶电泳检测荧光杂交信号。利用质粒为模板,优化了探针制作、杂交液组成、杂交时间和温度等参数。在FITC-dUTP:dTTP比例为1:3、模板质粒浓度为50μg、1×杂交缓冲液(25mmol/L Tris,10mmol/L EDTA, 8mmol/L Nacl,PH=8.0)中95℃变性5~9 min和42℃杂交3h的实验条件下,可检出1.2μg的质粒,探针灵敏度为7.3ng/μl。这种方法不需要转膜,曝光,大大节约了时间,简化了操作,荧光检测也为该方法同时检测多色样本提供了可能,可广泛应用于核酸检测。
• Select
  响应面法对小球藻Chlorella zofingiensis高产虾青素条件的优化

  王丹, 郑洪立, 纪晓俊, 高振

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 71-81.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  采用析因设计法(Plackett-burman)对影响Chlorella zofingiensis高产虾青素的相关因素进行评价,发现硝酸钠、光照强度、二价铁离子及醋酸钠浓度对虾青素产量影响显著。利用中心组合设计(central composite design)及响应面分析对影响虾青素产量的关键因素做进一步的优化,得到较佳的试验点为二价铁离子浓度0.41 mmol/L, 硝酸钠浓度0.8 mmol/L, 醋酸钠浓度37.1 mmol/L,光照强度650 E/m²×s。 优化后虾青素产量从7.890mg/L提高到19.81mg/L, 比优化前提高了2.5倍。
综述
• Select
  长链非编码RNA及其与肿瘤关系

  娄亮亮, 朱运峰

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 82-89.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  人类基因组DNA信息分析显示,基因组中编码序列不超过2%,其余为非编码序列,其中能够稳定转录的部分称之为非编码RNA(noncoding RNA, ncRNA)基因。依据ncRNA长度将其分为长非编码RNA(lncRNA,碱基数>200nt)和短非编码RNA(sncRNA)。在人体内,lncRNAs分布广泛,数目众多,并且大多数是由RNA聚合酶II转录的,且有5'端帽子结构以及3'端的多聚腺苷酸。就lncRNA的特征及其在肿瘤细胞中的功能进行阐述。
• Select
  DNA甲基化与基因表达调控研究进展

  史玉杰, 李庆贺, 刘晓辉

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 90-96.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  表观遗传修饰是指不改变DNA序列的、可遗传的对碱基和组蛋白的化学修饰,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA等。表观遗传修饰是更高层次的基因表达调控手段。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,参与基因表达调控、基因印记、转座子沉默、X染色体失活以及癌症发生等重要生物学过程。近年来随着研究方法和技术的进步,全基因组DNA甲基化的研究广泛兴起,多个物种全基因组甲基化图谱被破译,全局水平对DNA甲基化的研究不仅利于在宏观层面上了解DNA甲基化的特性与规律,同时也为深入分析DNA甲基化的生物学功能与调控奠定了基础。结合最新研究进展综述DNA甲基化在基因组中的分布模式、规律以及和基因转录的关系等。
• Select
  抗菌肽的设计及其应用

  陈宇婷, 王长海, 严秀文, 黎军胜

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 97-102.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  抗菌肽(AMP)是生物体内先天免疫系统的一个组成部分,保护机体免受致病微生物的入侵。抗菌肽具有很强的广谱抗菌活性,可抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒的生长。为克服微生物对抗生素耐药性的问题,目前阳离子抗菌肽已被考虑作为抗生素的潜在替代品。本文将阐述抗菌肽的作用机理、选择性抗菌肽的设计及其应用。
• Select
  用于重组抗体生产的细胞大规模培养技术

  刘伯宁

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 103-111.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  近年来,用于单抗药物生产的动物细胞大规模培养技术发展迅速。此领域的技术进展集中在个性化培养基开发,工艺条件优化等方面。本文总结了用于提高重组抗体表达水平的常用方法,以及细胞培养工艺对抗体药物"关键质量属性"(聚体、降解、糖基化修饰、电荷变异等)的诸多影响。此外,细胞培养工艺在产业化过程面临着工艺放大与技术转移,定性研究与工艺验证等实际问题。未来大规模细胞培养工艺的开发,将进一步借助动物细胞的组学研究成果和新兴的"过程分析技术"。
• Select
  基因佐剂的研究进展

  满朝来, 常杨, 唐高霞, 赵丽, 李凤, 甄鑫, 弭晓菊

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 112-117.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  基因佐剂是免疫佐剂家族的成员之一,随着研究的深入逐渐发现基因佐剂在佐剂应用中的重要价值。简要概括基因佐剂的概念和作用机制,同时总结了基因佐剂候选靶基因的几个发展方向,对基因佐剂的应用前景也进行了简单探讨,以期为基因佐剂在畜禽疾病防治和医学中的深入研究和应用提供参考。
• Select
  植物多糖分离提取技术的研究进展

  王如涛, 吴绵斌, 林建平, 杨立荣

  中国生物工程杂志. 2013, 33(7): 118-123.

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  植物多糖具有提高免疫、抑制肿瘤、延缓衰老和保护肝脏等重要生理作用,多糖的高纯度分离提取是多糖产业中极其关键的环节。本文对植物多糖的分离提取技术研究进展进行了概述,以期为植物多糖的产业化开发提供更有益的指导。对植物多糖的分离纯化工艺的发展趋势进行了展望。