目的:表达和纯化人TRIM5α嵌合体蛋白［TRIM5α-H(R328-332)］，并探讨该蛋白和HIV-1gag间的相互作用。方法:将构建的TRIM5α嵌合体pET
A型流感病毒H5N1神经氨酸酶奥司他韦敏感型及耐药突变型基因经优化后，克隆于pcDNA4/TO 表达载体，并转染T-REx293 建立稳定细胞株，经四环素诱导能特异表达神经氨酸酶，其活性被特异性抑制剂奥司他韦所抑制。利用该稳定细胞株制备的神经氨酸酶，对3000多种天然产物和中药提取物进行了筛选，结果显示黄芩甙和黄芩素对奥司他韦敏感型神经氨酸酶和耐药型神经氨酸酶具有相似的抑制作用。该神经氨酸酶制备方法安全、简便、稳定，有利于建立神经氨酸酶抑制剂的高通量筛选方法。A型流感病毒H5N1神经氨酸酶奥司他韦敏感型及耐药突变型基因经优化后，克隆于pcDNA4/TO 表达载体，并转染T-REx293 建立稳定细胞株，经四环素诱导能特异表达神经氨酸酶，其活性被特异性抑制剂奥司他韦所抑制。利用该稳定细胞株制备的神经氨酸酶，对3000多种天然产物和中药提取物进行了筛选，结果显示黄芩甙和黄芩素对奥司他韦敏感型神经氨酸酶和耐药型神经氨酸酶具有相似的抑制作用。该神经氨酸酶制备方法安全、简便、稳定，有利于建立神经氨酸酶抑制剂的高通量筛选方法。
制备一种γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物［Poly (γ-glutamic acid)D-galactose esterifiable derivative-Cisplatin Complex Compound，γ-D+-DDP］，并考察其体内靶向性。通过生物发酵获得大分子γ-聚谷氨酸［Poly (γ-glutamic acid)，γ-PGA］，利用酸降解得到可以作为药物载体的小分子γ-聚谷氨酸；利用凝胶色谱柱检验小分子γ-聚谷氨酸的分子量；利用HPLC检测释放的游离顺铂含量，得到复合物在小鼠体内靶向性分布情况；利用HE组织切片染色，观察脏器受损伤情况及靶向分布。实验结果表明：成功获得γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物，该复合物载药率达9.4%~10.2%；HPLC结果表明注射复合物后，肝脏中药物显著增加而肾脏中药物分布明显减少，大大减少了肾毒性，肝靶向作用明显。因此，γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物是一种有效的具有肝靶向性的抗肿瘤药物，具有潜在的临床应用价值；通过生物发酵获得的γ-聚谷氨酸可用于药物载体，赋予药物新的特点。介绍了制备一种γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物[Poly (γ-glutamic acid)-D-galactose esterifiable derivative -Cisplatin Complex Compound，（γ-D+-DDP）]，并考察其体内靶向性。通过生物发酵获得大分子γ-聚谷氨酸[Poly (γ-glutamic acid)，γ-PGA]，利用酸降解得到可以作为药物载体的小分子γ-聚谷氨酸；利用凝胶色谱柱检验小分子γ-聚谷氨酸的分子量；利用HPLC检测释放的游离顺铂含量，得到复合物在小鼠体内靶向性分布情况；利用HE组织切片染色，观察脏器受损伤情况及靶向分布。实验结果表明：成功获得γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物，该复合物载药率达9.4% ~10.2%；HPLC结果表明注射复合物后，肝脏中药物显著增加而肾脏中药物分布明显减少，大大减少了肾毒性，肝靶向作用明显。因此，γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物是一种有效的具有肝靶向性的抗肿瘤药物，具有潜在的临床应用价值；通过生物发酵获得的γ-聚谷氨酸可用于药物载体，赋予药物新的特点。
将已构建好的含有人多药耐药（multidrug resistance, MDR）全长基因的真核表达质粒pCI-neo-mdr1，应用脂质体导入人肝癌HepG2细胞，应用G418筛选出人肝癌多药耐药细胞株HepG2/mdr1。通过对HepG2/mdr1细胞形态学的观察和生物学特性的研究，成功地建立了高效、稳定的HepG2/mdr1细胞系；为深入研究肝癌的MDR及其逆转提供了理想的细胞模型，并为探索建立肝癌MDR细胞株提供新的方法和思路，同时为研究肝癌细胞胰岛素抵抗与MDR的关系提供了模型细胞。
将已构建好的含有人多药耐药（multidrug resistance, MDR）全长基因的真核表达质粒pCI-neo-mdr1，应用脂质体导入人肝癌HepG2细胞，应用G418筛选出人肝癌多药耐药细胞株HepG2/mdr1。通过对HepG2/mdr1细胞形态学的观察和生物学特性的研究，成功地建立了高效、稳定的HepG2/mdr1细胞系；为深入研究肝癌的MDR及其逆转提供了理想的细胞模型，并为探索建立肝癌MDR细胞株提供新的方法和思路，同时为研究肝癌细胞胰岛素抵抗与MDR的关系提供了模型细胞。
试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体，培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。结果显示通过RT-PCR扩增出918bp的小鼠Nanog基因，测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后，表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异，在无LIF的ES细胞培养液培养条件下，表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落，碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性，相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体，培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。根据小鼠Nanog基因m RNA序列设计Nanog基因引物，引物两端带有Nhe I和Xho I酶切位点。Trizol试剂处理小鼠ES细胞，通过RT-PCR扩增出小鼠Nanog基因，小鼠Nanog基因用Nhe I和Xho I酶切后连入pcDNA3.1载体中，PCR检测阳性的细菌克隆进行测序，测序正确的Nanog基因片段连接入PLL-IRES-Neo慢病毒表达载体中，包装含有Nanog基因的慢病毒感染小鼠ES细胞，在SNL细胞饲养层上G418筛选2周后，添加普通ES细胞培养液在普通小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上培养。结果显示通过RT-PCR扩增出918 bp的小鼠Nanog基因，测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后，表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异，在无LIF的ES细胞培养液培养条件下，表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落，碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性，相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。
探讨蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ
目的:利用BaculoDirect杆状病毒表达系统融合表达人OPG功能片段p22-194和分枝杆菌HSP70 p111-125基因，并鉴定重组蛋白及其生物学活性。方法:将编码人OPG功能片段和分枝杆菌HSP70功能片段基因克隆至杆状病毒转座载体，将重组转座载体与BaculoDirectTM Linear DNA进行LR重组连接反应，构建出重组杆状病毒DNA，转染Sf9昆虫细胞，获得重组病毒。在Sf9细胞中进行表达，并对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western blotting分析，用Ni柱纯化。采用破骨细胞生成抑制试验和抑炎试验鉴定表达产物的生物学活性。结果:重组病毒在感染昆虫细胞后48h开始出现一相对分子质量为28 kDa大小的特异条带，感染后72～96 h蛋白量达到高峰。破骨细胞生成抑制实验及抑炎试验结果显示，重组蛋白能明显抑制破骨细胞的生长和分化，同时亦具有抑制炎症反应的作用。结论:利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中成功表达OPG-HSP70融合蛋白，该融合蛋白具有抑制破骨细胞生成和抑制炎症反应生物学活性。
降低细胞内的氧气含量是提高莱茵衣藻产氢效率的重要手段之一。本研究首次尝试将豆血红蛋白基因lba转入衣藻叶绿体中表达，利用豆血红蛋白具有与氧可逆结合的特性，期望降低转基因衣藻细胞内的氧气含量，达到提高衣藻产氢效率的目的。实验结果证明，lba成功转入到衣藻叶绿体中，且对其生长没有产生显著影响，这为下一步调控Lba在衣藻叶绿体中表达活性和提高衣藻产氢效率奠定了实验基础。
