摘要 Twist是一个bHLH（basic Helix-loop-Helix）类型的转录因子，近年来研究发现，Twist在乳腺癌中的表达显著升高，并能促进乳腺癌的转移。为了探索Twist促进乳腺癌转移的分子机制，本文采用RNA干扰技术在小鼠乳腺癌细胞株4T1中沉默Twist的表达，通过全基因组基因芯片技术检测了Twist沉默前后4T1细胞基因表达谱的差异性。体内实验结果证明Twist表达被沉默后4T1细胞的肺转移能力明显被抑制。芯片结果表明：表达差异显著的基因有167条，其中与肿瘤相关的基因有26条，包括15条上调基因和11条下调基因。这些基因中可能存在能被Twist调控并与肿瘤转移相关的基因，为以后研究Twist影响乳腺癌转移的分子机制提供了帮助。
目的:构建靶向NBS1基因的 microRNA真核表达载体,鉴定其转染宫颈癌细胞株Hela后的生物活性?方法:根据NBS1mRNA序列设计合成四对pre- microRNA片段,定向克隆到pcDNA 6.2- GW/ EmGFP-miR真核表达载体上,并将其转染至Hela细胞株中?采用菌落PCR和测序分析鉴定插入序列的完整性;采用实时定量PCR分析鉴定重组体对NBS1mRNA表达的干扰效果以确定其生物活性? 结果:构建的四组重组体插入片段的碱基序列完全正确?重组体能干扰Hela细胞NBS1基因的表达,四组重组体NBS1 mRNA表达量分别为: 0.24±0.17 (NBS1mi-1组)?0.12±0.12 (NBS1mi-2组)?0.41±0.97 (NBS1mi-3组)?0.48±0.93 (NBS1mi-4组),其中NBS1mi-2组表达最低? 结论: 构建的四组NBS1 microRNA重组体在Hela细胞株中都具有生物活性, 且NBS1mi-2组的干扰作用最强? 载体构建成功,为应用microRNA靶向NBS1的肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。
利用pDispaly真核表达载体构建了用于表达中国流行株HIV-1 gp120的真核表达质粒pD-120，通过脂质体转染法将其导入人宫颈癌细胞（HeLa），经G418反复加压筛选，直到细胞不再死亡为止，8代后获得稳定表达中国流行株HIV-1gp120蛋白的靶细胞复制模型HeLa-gp，SDS-PAGE、蛋白印迹与间接免疫荧光分析表明，重组蛋白得到很好表达，并具有良好生物活性。本研究为抗AIDS/HIV治疗用基因工程制剂或靶向药物的活性检测奠定了坚实基础。
目的：用聚乙二醇（PEG）修饰集成干扰素突变体Ⅱ（IFN-Con-m2，IIFNm2），通过纯化获得新型修饰分子并对该分子进行抗胰蛋白酶水解稳定性及初步药代动力学研究。 方法：将mPEG20000定点偶联到IIFNm2的第86位Cys残基上，修饰后的产物经CM层析后，以SDS-PAGE考察其纯度，用WISH-VSV系统进行生物活性测定；在0.1%胰蛋白酶条件下考察体外抗酶解稳定性；并以SD大鼠进行初步药代动力学研究，绘制血药浓度-时间曲线。采用3P87软件进行数据拟合，分析药物动力学参数。 结果：干扰素修饰率约为50%，且绝大多数以单修饰体（mono-PEG- IIFNm2）形式存在；提纯后mono-PEG-IIFNm2 的纯度大于98%，比活性约为修饰前IIFNm2的1%。抗胰蛋白酶水解试验表明：30min后，IIFNm2抗病毒活性残留为8%，mono-PEG-IIFNm2为41%。初步药代动力学研究显示：IIFNm的消除半衰期为(1.57±0.34)h，mono-PEG-IIFNm2为(18.0±4.0)h。 结论：成功地偶联了PEG和IIFNm2，建立了mono-PEG-IIFNm2的纯化工艺，PEG修饰能增加IIFNm2的体外抗胰蛋白酶水解稳定性，并显著延长体内半衰期。
Humanin（HN）是近年来在人体内发现的内源性多肽，能够保护神经细胞免于各种阿尔采默病病相关因素诱导的凋亡，HN肽链第14位氨基酸被Gly取代的突变体[Gly14]-Humanin（HNG），神经保护活性比HN高近1 000倍。但由于HNG天然获取的途径有限，限制了对其功能的进一步研究。本课题组构建了HNG的表达质粒pET32a/HNG，并将其转化大肠杆菌BL21 trxB (DE3)，诱导表达后HNG以可溶性融合蛋白的形式出现并用镍离子亲和层析纯化，纯化的融合蛋白用肠激酶切割后经反相层析得到纯化的HNG多肽（23 mg每1 L细菌培养液），重组HNG多肽的分子量经电喷雾电离质谱（ESI-MS）检测为2876.5道尔顿，其N末端8个氨基酸残基的序列经Edman降解法测定为A-M-M-A-P-R-G-F，均与理论值一致。神经细胞保护实验表明，重组HNG多肽的神经保护作用与天然的HNG相近
本研究构建FMDV WFL株ORF(open reading frame)基因真核表达质粒pEGFP-C1-A3I3，并进行了表达研究和共转染研究。结果发现，该质粒可以在BHK-21细胞中表达。将其与体外转录获得的FMDV RNA共转染BHK-21细胞后，用夹心ELISA、RT-PCR法以及电镜观察证明共转染后的细胞培养液中有病毒粒子，且病毒量高于单独转染RNA所得病毒量。证明用FMDV基因组真核表达质粒与其基因组体外转录RNA共转染敏感细胞可提高拯救病毒的数量。
应用PCR技术从鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA中克隆phoQ基因片段，构建原核表达pUC18重组质粒，测定序列(GenBank登录号为DQ787014)，并转入鼠伤寒沙门氏菌，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，进行高效表达。对重组菌株、野生菌株进行毒力检测对比实验，通过口腔注入45日龄健康无菌KM小鼠，测定其半数致死量(LD50)。结果发现：重组菌株与野生菌株的毒力存在显著差异，其半致死量分别为3.981×107 cf u/ mL and 5.012×102 cf u/ mL，PhoQ基因重组菌株的毒力远远低于非重组菌株。说明phoQ基因是调节鼠伤寒沙门氏菌致病机制中一个重要的调节因子。
为研究hCD46在菌毛介导的淋病奈瑟菌宿主特异性黏附过程中的作用。用连接PCR技术扩增出启动子与cDNA相连的hCD46小基因，并将其置换出pcDNA3.1载体中的CMV启动子，构建成重组真核表达载体pCD46。转染COS-1细胞后用间接免疫荧光法检测到hCD46 cDNA在其自身启动子的指导下可在COS-1细胞膜表面有效表达，Western blotting检测表明表达产物的分子正确，用流式细胞术分选表达hCD46的基因转染细胞COS-1-46。细菌黏附实验显示菌毛阳性淋病奈瑟菌临床分离株对COS-1-46细胞有较强的黏附性。提示hCD46是菌毛介导的淋病奈瑟菌特异性黏附于人黏膜细胞的一种重要受体，hCD46小基因可用于淋病奈瑟菌感染转基因小鼠模型的制备。
目的：建立rCPM36在大肠杆菌中的表达体系，纯化表达产物并检测其抗原性。方法：运用PCR方法从禽多杀性巴氏杆菌国际标准株P1059基因组中扩增出编码36kDa成熟黏附蛋白的cpm36基因，构建原核表达载体pQE30-cpm36，转化到大肠杆菌M15中并诱导表达目的蛋白，用镍离子螯合层析柱纯化目的蛋白及制备其抗体，Western印迹分析其抗原性。结果：SDS-PAGE结果显示目标蛋白以可溶性形式表达在大肠杆菌M15细胞质中，其相对分子质量为37kDa，Western印迹结果表明表达蛋白具有良好的抗原性。结论：成功构建出原核表达载体并实现了目的蛋白表达，用镍离子螯合层析柱纯化得到具有抗原性的蛋白，为进一步开展禽多杀性巴氏杆菌黏附因子和保护性抗原的研究奠定基础。
为提高转基因盐藻的表达效率，利用基因组步行方法和巢式PCR，从盐藻中克隆了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）的小亚基基因rbcS 的5'上游调控序列，并对其进行序列分析和转基因功能分析。采用Dra I、EcoR V、Pvu II和Stu I四种平端限制内切酶分别酶切盐藻基因组DNA，并与接头连接，构建基因组步行文库GWL 1、GWL 2、GWL 3和GWL 4；设计特异引物从这四种文库中扩增rbcS基因的5'上游调控序列。在GWL 1、GWL 4中分别扩增出约1.2 kb的片段。对该序列的分析表明，它的3'端与已知盐藻rbcS cDNA 的5'端序列完全一致，说明是该基因的5'端上游区，并且包含多个与转录调控有关的保守序列（如TATA-box、CAAT-box），富含GT的重复序列。此序列EcoR I下游的片段与除草剂抗性基因bar相融合，构建表达载体，电击法转化盐藻。通过对转化藻株的抗性筛选以及PCR和Southern blot检测，表明该区域能驱动外源基因bar在转基因盐藻中的表达，推断是盐藻rbcS基因的启动子调控区。
利用CHO细胞能在培养过程中自然结团的特性，采用超声—沉降柱二合一灌流系统能促进细胞结团和加强截留的特性，我们用无血清培养基连续灌流培养基因重组CHO细胞MK3-A2株，分泌表达rhTNK-tPA获得了成功。培养周期为77-110天，细胞结团率为90%左右，直径在285～570μm之间，细胞截留率保持在95%左右，成活率为85%以上，细胞密度达到2×107/ml左右，rhTNK-tPA生产率平均为89 mg/L/d，最高时达216mg/L/d。 结果表明，使用该灌流系统进行细胞结团培养可以取代微载体培养用于动物细胞制药的规模化生产。
以富马酸产量和生产速率为目标，通过正交实验考察了种龄，接种量，葡萄糖和尿素浓度对两者的影响，进一步利用基于响应曲面方法的Desirability函数确定了葡萄糖和尿素的最佳浓度。结果表明，最佳的种龄和接种量分别为36h和15%，葡萄糖和尿素的优化浓度为132.73和0.0586g/l，此时模型预测的富马酸产量和生产速率达到71.42g/l和0.804g/(l.h)，Desirability的函数值高达0.966。该条件下在5L发酵罐水平上进行验证试验，经过88h的发酵最终生成富马酸66.5g/l，生产速率达到0.755 g/(l.h)，与未优化前相比，产量和生产速率分别提高了13.9%和15.8%，取得了理想的效果，实现了产量和生产速率的同时优化，为发酵法制备富马酸的工业化放大奠定了基础。
从肺炎球菌YF05中扩增了肺炎球菌表面蛋白A（PspA）和肺炎球菌表面黏附素A（PsaA）基因,以pET27b(+)为载体构建了重组表达质粒的表达系统后，转化入大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达，表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的75％，结果显示：表达的PspA蛋白和PsaA蛋白，分子量分别约为75kDa和37kDa。成功表达的重组蛋白具有较强的免疫活性和交叉免疫效果。
［摘要］目的: 克隆人钙网蛋白（calreticulin，CRT）并在E.coli中原核表达和纯化。方法：采用RT-PCR 法从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人钙网蛋白cDNA，构建CRT原核表达质粒（pET-15b/CRT）并转化E.coli 的Rossetta菌株。IPTG诱导后，表达蛋白在变性条件下经Ni-NTA 树脂亲和层析纯化,然后透析复性。分别用SDS-PAGE和Western blotting法鉴定CRT表达和纯化状态。结果：从A549细胞总RNA中成功获得人CRT cDNA克隆，重组质粒pET-15b/CRT构建正确。转化pET-15b/CRT的E.coli Rossetta诱导性表达重组人CRT蛋白，该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论：成功建立了CRT原核表达和纯化的实验方法，该方法为后续的CRT蛋白功能研究奠定了基础。
以发根农杆菌A4菌株诱导的人参发根为材料，用改良的异硫氰酸胍法提取总RNA，得到了纯度好的完整的总RNA。利用RT-PCR扩增了β香树素合成酶基因，测序结果表明该目的片段与Gene Bank上的β香树素合成酶基因序列一致。这一基因重组入克隆载体pMD-119T， 并转化大肠杆菌。 在此基础上，利用pBI121质粒载体，构建了人参β香树素合成酶基因的反义植物表达载体，为这一基因的反义调控研究打下基础。
目的：利用转基因何首乌毛状根悬浮培养体系对青蒿素等8种活性化合物进行生物转化研究。方法：分别向预培养9 d的何首乌毛状根培养体系中加入底物，共培养7 d后终止转化，通过TLC和/或HPLC检测转化产物，使用柱色谱法分离纯化产物。结果：化合物呋喃橐吾酮（6）发生了生物转化，并分离得到两个转化产物；对苯二酚（7）被转化，分离并鉴定出1个转化产物；青蒿素（8）发生了转化，分离得到两个转化产物。结论：转基因何首乌毛状根悬浮体系中存在多种生物酶系统，可对外源底物进行糖基化、氧化、还原和羟基化修饰。
抗菌肽广泛地存在于自然界中，其中许多抗菌肽具有直接抗微生物活性，能作用于G-、 G+细菌、真菌、寄生虫甚至是包膜病毒，并且在宿主先天免疫和适应性反应中有重要的调节作用。近来，越来越多的证据表明抗菌肽是有效的免疫辅助因子，能够与其他的众多免疫效应子协同作用，从而起始适应性免疫，促进伤口愈合，抑制前炎症反应以及诱导和调节细胞因子和趋化因子的产生。另外，随着抗菌肽作用机理逐渐被揭开，将这些内源性肽及其衍生物制成抗感染治疗药剂将会有广阔的应用前景。
摘要：细菌的群体感应是一种群体行为调控机制。自然界中的很多细菌都有这种能力，即分泌一种或多种信号分子，通过这些信号分子的浓度来感知菌群密度，调控一系列相应靶基因的表达。在这些受调控的基因中，备受关注的是信号分子对抗生素生产的调节。本文综述了群体感应机制的最新研究进展和它对抗生素生产的调节，尤其对洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia. cepacia)进行了较为详细的探讨。
巨大芽孢杆菌是一种很有潜力的分泌型基因工程宿主菌，现已广泛应用于工业和学术研究领域。它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等优点。本文综述了其自身的优点，表达载体的特点,巨大芽孢杆菌的转化方法，外源蛋白的表达，以及高效表达的策略，并对未来进行展望。
透明质酸（Hyaluronan, HA）是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖为双糖单位交替连接而成的粘多糖物质。目前构建基因工程菌成为提高产量和改善品质的重要手段。本文从发酵菌种、操纵子、关键酶和工程菌构建等方面，综述了链球菌HA生物合成的分子机理，分析了当前生产中存在的问题，并提出了解决问题的方法。
环境的污染在全球变得越来越严重。目前常用的环境污染治理措施不但费用大，效率底，往往还对生态环境本身带来其他的破坏。植物修复技术已在治理环境污染中越来越受到重视。本文综述了植物修复技术的五种应用方式：植物提取、植物降解、植物挥发、植物过滤和植物固定技术对环境污染的修复作用及其机理，并总结了通过遗传工程改良技术来提高植物修复环境污染的能力的研究进展。
