目的 利用蛋白质组学方法和激光扫描共聚焦显微镜来鉴定帕金森病相关蛋白PINK1和α-突触核蛋白（α-synuclein）之间的相互作用关系及两种蛋白在MN9D细胞中的分布。方法 将α-synuclein基因插入pGEX-4T-1载体，经DNA测序证明形成GST融合蛋白，经大肠杆菌BL-2l表达纯化后，与MN9D细胞裂解液共孵育，检测PINK1与α-synuclein蛋白间的相互作用。并应用MN9D细胞的内源性PINK1与α-synuclein进行免疫共沉淀实验，进一步验证两蛋白之间的相互作用。MN9D细胞经免疫细胞化学染色，利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白的细胞内分布及共定位状态。结果 利用GST-α-synuclein融合蛋白捕获及免疫共沉淀技术，检测到特异的PINK1条带。激光扫描共聚焦显微镜检测到两者存在部分共定位。结论 PINK1和α-synuclein在体外和细胞内均可发生相互作用并在MN9D细胞中存在共定位关系。
目的：人色素上皮细胞衍生因子 (pigment epithelium-derived factor, PEDF)是一种有效的新生血管形成抑制因子和神经营养因子。本文通过原核细胞表达人PEDF蛋白，鉴定其抑制新生血管的生物学活性。方法：采用PCR法扩增人PEDFcDNA，将其克隆到pET32a载体中，在大肠杆菌BL21中表达人PEDF蛋白。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后，镍柱亲和层析法变性条件下纯化重组融合蛋白。Bradford法测蛋白浓度，采用鸡胚脲囊膜法测其对新生血管形成的影响。结果：成功构建了pET32a-PEDF表达载体。重组人PEDF蛋白在BL21宿主菌中获得了稳定高效表达，鸡胚脲囊膜实验结果显示在重组蛋白浓度为0.4、0.04 ng/ml时均有对新生血管的显著抑制作用（P<0.01），而在4 ng/ml时无抑制作用。结论： 成功高效表达及纯化了重组人PEDF蛋白，鉴定其抑制新生血管的生物学活性，并且证实该活性在一定范围内有效，为进一步研究其功能及推广应用奠定了基础。
目的：通过结构分析和定点突变，构建干扰素α-2bHis89/His159(IFNα-2bHis89/His159)，以期获得高性能干扰素突变体。方法：采用PCR体外定点突变技术，使干扰素α-2b基因的第89位密码子由编码酪氨酸的TAC突变为编码组氨酸的CAC，第159位密码子由编码谷氨酸的GAA突变为编码组氨酸的CAC。将扩增片段克隆入pET23b表达载体，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。表达的IFNα-2bHis89/His159经包涵体变性、复性、DEAE层析和CM层析纯化后，用WISH-VSV系统进行生物活性测定。以SD大鼠进行初步药代动力学研究。结果：IFNα-2bHis89/His159主要以包涵体形式表达，表达量占菌体总蛋白的40%以上。纯化后，IFNα-2bHis89/His159的纯度大于95%，比活性大于2.8×108IU/mg。相对于IFNα-2b较短的消除半衰期，IFNα-2bHis89/His159的消除半衰期得到延长，为2.34±0.27h。结论：构建了IFNα-2bHis89/His159的重组表达载体，并成功地在大肠杆菌中实现了高效表达，建立了IFNα-2bHis89/His159的纯化工艺，获得了体外活性增高并且体内稳定性得到改善的新型干扰素α-2b突变体。
经生物学软件DNA Star分析，将牛呼吸道合胞体病毒G基因截短成2个片段G1和G2。然后用人工合成的牛呼吸道合胞体病毒G基因为模板，用PCR分别扩增G1和G2基因片段，其大小分别为570 bp和308 bp。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中，酶切及测序鉴定均正确后，转化BL21表达菌，经IPTG诱导后G1和G2基因片段都获得了表达，且都为可溶性表达。用Ni柱亲和层析法在非变性条件下纯化重组蛋白，经免疫印迹试验鉴定证明纯化的重组蛋白G1具有良好的抗原性和特异性，而重组蛋白G2无反应性。应用纯化的重组蛋白G1进行的间接ELISA与免疫印迹试验在国内牛血清中检测到了BRSV血清抗体。本研究所表达的重组蛋白G1为基于牛呼吸道合胞体病毒G蛋白的血清学诊断方法的建立与牛呼吸道合胞体病毒G蛋白生物学功能的研究奠定了基础。
以克雷伯氏菌基因组DNA为模板，扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因dhaD，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上，在E.coliBL21（DE3）中诱导表达，利用表达载体pET-28a(+)上的6·His-Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的甘油脱氢酶(GDH)，纯化后比酶活达到156U/mg，纯化倍数达4.6倍，回收率为67.4%。并初步研究了该酶的酶学性质，酶反应的最适pH为11.0，在pH7.0～12.0范围内稳定；酶反应的最适温度为30℃，稳定范围为25～45℃; 酶动力学参数以甘油为底物的Km为0.54 mmol/L, Vmax为0.49 μmol/(mL·min)。
设计表达了四个锌指核酸酶，用于切断人基因组中的rRNA基因家族的内部转录间隔序列，造成双链断裂，以此提高针对多位点基因打靶的效率，为后续基因打靶应用于基因治疗研究奠定基础。首先，在人rRNA基因家族ITS1序列中找到两个合适的9 bp长的序列(中间间隔6 bp)为锌指蛋白识别位点，根据识别位点序列每个位点分别设计两个三锌指蛋白。通过设计引物进行重叠延伸PCR得到全长编码锌指蛋白的DNA，分别克隆到表达载体pET-28a（+），构建重组质粒pET28a-ZFP，转化大肠杆菌RossettaTM（DE3），实现带组氨酸标签的锌指融合蛋白的表达与纯化。同时，将限制性内切酶Fok I的切割结构域分别与四个锌指蛋白序列采用PCR拼接后克隆到表达载体pET-28a（+），构建重组质粒pET28a-ZFN，转化到大肠杆菌RossettaTM（DE3），实现带组氨酸标签的锌指核酸酶融合蛋白的表达并纯化。
在M9培养基的基础上，以乳糖为诱导剂，对基因重组蛛丝蛋白工程菌pNSR32/BL21(DE3)的发酵培养基进行了优化。利用单因子实验和正交试验优化出表达高分子量重组蛛丝蛋白的最优培养基配方，结果表明：优化的碳源为0.3%的甘油，氮源为3%的酵母膏、0.75％的蛋白胨和0.05％(NH4)2SO4及少量的无机盐。优化培养基有利于菌体的生长和目的蛋白的表达，表达重组蛛丝蛋白达总蛋白量的20%。
本文研究了利用电融合技术得到麦角甾醇工程菌株发酵玉米秸秆糖化液制备麦角甾醇的工艺条件，在摇床水平上研究了初始糖度，氮源，pH值，发酵时间对产麦角甾醇的影响。依据DPS的中心组合实验设计原理，采用4因素3水平的响应面分析方法，对工艺条件进行优化。结果显示，该4因素对麦角甾醇的积累存在显著相关性，在最佳工艺条件下摇床振荡培养32 h，生物量达8.67g/L，麦角甾醇含量可达2.37%。同时对玉米秸秆发酵产麦角甾醇晶体进行结构表征，为生物质资源的应用开辟新的途径。
对木薯体细胞胚胎发生的影响因素进行了优化研究。结果表明，基因型对木薯体细胞胚胎发生影响很大，在供试的六个品种中，“华南 8 号”的体细胞胚胎发生率和产胚量最高，分别为 65% 和19个；侧芽茎尖为最佳外植体，体细胞胚胎发生的最佳培养基为MS +0.5mg/L CuSO4 + 4 mg/L 2,4-D。同时，对木薯体细胞胚再生成完整植株的主要影响因素作了分析，建立了一个高效的植株再生体系。
在动物克隆研究中，研究者普遍认为位于细胞周期的G0+G1期的二倍体细胞对于核移植中供核细胞的重新程序化是必需的。本文探讨了血清饥饿、汇合培养及放线菌酮（CHX）处理对不同传代次数的体外培养奶牛成纤维细胞周期分布的影响。流式细胞仪分析结果显示：第3代和第13代细胞经血清饥饿处理72h后，细胞周期分布与对照差异显著(P<0.05)；汇合培养可以显著增加奶牛成纤维细胞处于G0+G1期细胞数。CHX处理第3代细胞经CHX处理后处于G0+G1期的细胞数差异不显著，而第13代细胞处理后差异显著。结果表明体外培养奶牛成纤维细胞高代对血清饥饿、汇合培养及CHX处理更敏感。
本文介绍一种称为CapFinder的技术，可用于克隆基因mRNA序列的5'末端非翻译区全长。该技术是利用某些反转录酶在反转录达到mRNA的5'末端帽结构时表现出很高的加尾活性(主要添加dC)这一特点，在反转录体系中加入一种带GGG的寡核苷酸序列，当反转录反应到达mRNA模板的5'末端帽结构时，切换到以该寡核酸为模板继续进行反转录反应，即可合成完整的cDNA一链，且在其3'末端还带有一段额外的寡核苷酸序列。用GGG寡核苷酸序列为上游引物和基因特异性的下游引物进行PCR即可扩增得到mRNA5'末端非翻译区的全长。利用该技术克隆了棉铃虫幼虫中肠Bt毒素受体E-钙粘素基因的5'末端非翻译区序列。
以东农冬麦1号为材料，对苗期地下茎处的蛋白提取方法、蛋白溶解、上样量、胶条的转移等方面进行试验，结果表明：在蛋白提取方面，TCA/丙酮法（T法）和尿素/硫脲法（N法）相比T法能减少低丰度蛋白的损失得到蛋白点数更多的图谱；在蛋白溶解方面，经过两次水化液溶解的蛋白纯度较高，在等电聚焦时能保持8000伏较高电压；上样量方面，10mg粗蛋白溶于两次水化液能得到清晰、分离效果好、蛋白点数较多的图像；胶条转移方面，先向胶面中加入400μl 0.3％普通琼脂糖溶液后，用200μl的电极缓冲液冲洗胶条的支撑膜会使胶条顺利转移到第二向胶面上且胶条与胶面间不会产生气泡。
以小鼠胚胎干细胞（ES）为种子细胞，使用改良的4-/4+ RA方案，诱导小鼠ES细胞在丝素材料上向神经细胞分化，探讨丝素材料对其生长、黏附、分化等情况的影响。将小鼠ES细胞悬浮培养4 d得到的拟胚体（EBs）分别接种到经丝素膜和明胶包被的培养皿上进行诱导，比较不同材料上EBs的贴壁率及向神经元分化的比率。结果表明EBs在明胶和柞蚕丝素蛋白膜（TSF）上贴壁较快，平均贴壁率为90.3%和84.4%，在桑蚕丝素蛋白膜（SF）上贴壁较慢，贴壁率低，仅为38.5%，同时三者神经元的分化比率均能达到40%以上，无明显差异。通过以上实验，我们得出，TSF有望成为小鼠ES细胞向神经细胞分化的支架材料。
为提高乳清酸到尿嘧啶核苷酸(UMP)的转化效率，利用PCR方法扩增酿酒酵母乳清酸磷酸核糖转移酶基因URA5, 并将其连接到携带乳清苷酸脱羧酶基因URA3的表达载体pYX212中，构建了重组质粒pYX212-URA5，然后转化到酿酒酵母BJX12中进行表达，并进行转化乳清酸到UMP的初步研究。试验结果表明: pYX212-URA5/ BJX12发酵培养40h后以32 mM乳清酸为底物催化产生UMP的量约为7 mM。明显高于同等条件下pYX212/ BJX12的UMP产量2.7 mM和对照组野生型BJX12的UMP产量2.4 mM。
肿瘤细胞表面抗原的表达量低，免疫原性弱，因抗原构象改变的原因，用传统的固定化抗原方法很难获得有价值的噬菌体抗体。这类抗原大多具有复杂的结构，且其转运、定位与细胞类型及所处的微环境有关。在基于细胞的筛选中，靶抗原以天然状态存在，不需纯化，甚至可以对未知抗原进行筛选，因此广泛用于对内化抗体和血管内皮抗原表位抗体的筛选。基于细胞的抗体筛选中的主要问题是因非特异结合造成的选择背景过高，迄今，已有许多旨在改善选择灵敏度和特异性的研究开展起来。随高通量流式细胞术、组合化学及蛋白质组学研究技术在细胞筛选中的运用，必将使其日趋实用和成熟。我们拟以细胞和组织筛选的技术做一概括，为了解基于细胞的筛选和优化设计提供参考。
Red重组作为一种新的重组系统已经被广泛用于大肠杆菌的基因敲除、基因替换。与传统的Rec重组相比，Red重组具有同源臂短，重组效率高等优点。本文分别详细介绍了Red重组系统中Exo、Beta、Gam三种蛋白质的功能，Red重组系统运用在大肠杆菌基因敲除中的三种质粒及其功能，同时概括了Red重组的技术要点及技术难点，分析了文献报道的阿拉伯糖诱导浓度和诱导时间、转化后的复苏温度及时间、引物同源臂长度对于重组率的影响，总结出了Red重组的最佳条件。
微小RNA(microRNA, miRNA)是一类长度为二十几个核苷酸的内源性非编码调控RNA，通过序列特异性翻译抑制或mRNA裂解来调控基因表达，参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学进程。近期的研究发现，miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用，在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。已发现若干miRNA直接参与肝细胞癌的发生和发展，miRNA表达谱与肝细胞癌的诊断、分期、进展和预后等相关。作为一类新的分子靶标，miRNA应用于肝细胞癌的诊断和生物治疗具有广阔的前景。
近年来，因瘤胃微生物产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes具有高的琥珀酸产量，并能够利用多种碳源进行发酵等优点，在利用发酵法生产琥珀酸领域具有广泛的应用前景和商业化价值，因而其代谢途径和发酵工艺等基础研究成为国内外研发的热点。近年来，人们在产琥珀酸放线杆菌的代谢途径、琥珀酸发酵动力学模型、新型经济培养基以及高产菌株选育等方面的研究取得了很大进展，对研发琥珀酸发酵工艺、降低生产成本和节能减耗等具有重要的理论意义。
老年性痴呆(Alzhimer's disease，AD)是一种渐进性神经退化性疾病，其主要表现为记忆功能衰减及识别能力障碍，同时伴有各种神经症状和行为障碍，具有非常高的发病率，目前还没有特异性治疗药物。随着世界人口老龄化，AD发病率逐年增高，成为本世纪威胁人类健康最严重的疾病之一。近年来AD的发病机理和药物研究方面都有突破性进展，尤其是制备针对β淀粉样蛋白（amyloid beta protein，Aβ）特异性抗体药物成为AD治疗极具价值的途径。本文主要对以Aβ为主的AD发病机理和针对Aβ的抗体药物的治疗机制、研究现状及进展进行综述，为进一步研发AD治疗药物提供参考。
长链不饱和脂肪酸（LC-PUFAs）对人类健康具有重要作用，通过转基因植物生产LC-PUFAs具有低成本、可持续、污染少等诸多优势。本文简要介绍了LC-PUFAs的作用、来源及其植物生物合成途径，综述了转基因植物合成LC-PUFAs的研究进展，并对如何进一步提高LC-PUFAs产量进行了探讨。
酵母细胞表面展示表达系统是一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定）使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。它利用细胞表面展示技术使外源蛋白固定化于细胞表面，从而生产微生物细胞表面蛋白，可应用于生物催化剂、细胞吸附剂、活疫苗、环境治理、蛋白质文库筛选、高亲和抗体、生物传感器、抗原／抗体库构建、免疫检测及亲和纯化、癌症诊断等领域。国内对这一方面研究较少,本文主要介绍了该技术的基本原理、研究现状、应用及其发展前景。
