2006年, 第26卷, 第08期　
刊出日期：2006-08-25

  

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专题
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  影响草地早熟禾（Poa pratensis L.）基因枪转化关键因素研究

  韩烈保,信金娜,刘君

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 1-4.

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  将含有DREB1A基因的表达载体，通过基因枪法转化草地早熟禾的胚性愈伤组织，探讨了金粉沉淀剂、金粉直径等因素对转化的影响，同时通过不同浓度潮霉素（Hygromycin，简称Hy）对未转化愈伤组织的筛选，获得最佳筛选浓度。结果表明，适合于草地早熟禾基因枪轰击的条件为：Ca（NO3）2＋PEG4000包被质粒DNA；1μm金粉作为质粒DNA的载体；合适的轰击高度为6cm、轰击次数为1次、无渗透处理。采用Hy作为草地早熟禾转基因植株抗生素筛选标记时，Baron品种愈伤组织继代的临界筛选浓度为100mg/L。
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  CMO与BADH双基因表达载体构建及在烟草中的表达

  刘,君,韩烈保,陈其军,信金娜,何宇峰,李雪

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 5-9.

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  本研究的目的是将甜菜碱合成关键酶CMO与BADH基因构建到同一表达载体中，利用转基因方法将该表达载体导入植物体内，完善植物体内的甜菜碱合成途径，提高植物的抗旱性和耐盐性。以pC1303质粒为基础，构建了均由35S启动子驱动的CMO基因和BADH基因的植物双基因表达载体pC35SC35SB1303。利用冻融法将其导入农杆菌LBA4404中，通过农杆菌介导法分别将CMO基因、BADH基因以及该双基因表达载体导入烟草中，PCR检测和Northern杂交分析表明，外源基因已整合到受体植物基因组中并正常表达。对转基因植株及对照植株甜菜碱含量的检测结果表明，转双基因植株的甜菜碱含量明显高于转BADH基因植株、转CMO基因植株及对照植株。
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  基因枪转化法获得草地早熟禾（Poa pratensis L.）转基因植株

  信金娜,韩烈保,刘君

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 10-14.

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  将与植物抗旱耐盐有关的BADH-CMO双基因、CMO单基因、DREB1A单基因三种外源基因通过基因枪法分别轰击草地早熟禾的胚性愈伤组织，经过一系列筛选与再生培养，得到了抗性植株。经过PCR、Southern杂交分析检测，证明BADH-CMO双基因、CMO基因、DREB1A基因已经成功整合到草地早熟禾的植物基因组中。
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  高羊茅转基因研究进展

  王维飞,韩烈保,曾会明

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 15-21.

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  高羊茅为很重要的多年生冷季型草坪草，生物技术在其品种改良中具有很大的应用潜力。本文对高羊茅植株再生体系的建立及遗传转化方面的研究进展进行了综述。同时，对高羊茅转基因研究中存在的问题和前景作了讨论。
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  植物赤霉素矮化突变体研究进展

  王月华,韩烈保,曾会明,尹淑霞,秦利军

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 22-27.

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  赤霉素(GAs)在植物种子萌发、茎的伸长和花的发育等方面起着非常重要的作用。近年来，随着研究手段和技术不断进步，对赤霉素(GA)生物合成和信号传导过程中相关基因的研究取得了惊人的进展。与GA有关的矮化突变体主要有GA缺陷型和不敏感型两类，本文对与GA生物合成和信号传导过程中有关的这两类矮突变体的研究进展进行综述。对这些这些突变体的研究促进了对赤霉素生物合成和信号传导途径的认识，同时为赤霉素更好地利用提供了科学依据。
研究报告
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  丙酮酸甲酸裂解酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及酶学性质的研究

  杨登峰,韦宇拓,周兴,黄志民,黄日波

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 28-31.

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  丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate format-lyas，PFL）是厌养或兼性厌养微生物中，代谢途径的关键酶之一，为了进一步研究其功能，我们以大肠杆菌JM109菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增大肠杆菌中的pfl基因，为测序方便将所得DNA片段连接到pMD18-T载体上，将测序正确后的pfl基因连接到表达载体pET-22b(＋)中，重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达, 通过SDS-PAGE电泳分析，在分子量为85kDa处出现新生的蛋白条带。利用金属亲和层析对添加了6×组氨酸标签的PFL进行纯化，对PFL的酶学性质进行了研究。结果表明：此酶的最适温度为35 ℃，最适pH为7.5，米氏常数Km＝2.3mmol，Tm＝49.9℃。
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  鲁氏酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因（ZrGPD1）在粉状毕赤酵母中的表达

  张洁,陈献忠,沈微,唐雪明,诸葛健

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 32-36.

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  为探索在野生型粉状毕赤酵母（Pichia farinosa）中整合表达来源于耐高渗鲁氏酵母（Zygosacharomyces rouxii）的3-磷酸甘油脱氢酶基因（ZrGPD1）以提高产甘油能力的可行性，应用PCR方法从P. farinosa的染色体中扩增出乳清苷酸脱羧酶基因（URA3）片段，以此作为同源整合的靶序列，构建了整合型表达载体pUR-ZG。电击转化粉状毕赤酵母，以抗生素Zeocin为筛选标记，获得转化子pfa-gu，摇瓶发酵结果表明：以P. farinosa作为对照菌株，发酵72h后，转化子pfa-gu的生物量和甘油含量均高于对照菌株，其中甘油含量达到37g/L，比对照提高了30%。结论：在P. farinosa中异源表达ZrGPD1能够提高细胞的产甘油能力和对渗透压的调节能力。
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  猪戊型肝炎病毒基因ORF2片段AG02的融合表达及间接ELISA方法的初步建立

  张可心,赵敏,郭巍,于敏,赵宇军,相文华

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 37-41.

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  采用巢式RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒（SHEV）结构蛋白基因ORF2部分片段AG02。将该片段插入pET32a表达载体，命名为PET-HEV，将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE-3），经1mM IPTG诱导得到表达，进行SDS-PAGE分析，证明该片段得到融合表达，分子量为33KD。Western blot分析表明，重组蛋白可以与HEV阳性血清反应，表明该蛋白具有良好的抗原性。以纯化的重组蛋白建立了初步的间接ELISA方法,经方阵滴定确定最佳包被浓度为2.43μg/mL，血清最佳的稀释比为1:40,与万泰试剂盒相比较，证明我们建立的ELISA方法有较高的特异性和敏感性。
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  用两步MS-PCR结合ELISA检测HIV-1逆转录酶基因的耐药性突变

  何红秋,程绍辉,刘斌,陈慰祖,王存新

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 42-46.

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  高效抗逆转录病毒治疗法（HAART）的推广使用有效地抑制了HIV-1病毒的传播和艾滋病（AIDS）的发病率、死亡率。近年来，HIV-1逆转录酶基因突变所导致的耐药性成为了HAART的治疗失败的主要原因，耐药性突变的检测对于指导病人用药以及新药开发具有重要意义。本工作发展了一种检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变的新方法。采用两步MS-PCR方法检测HIV-1 B亚型野生型和耐药突变型逆转录酶基因突变，检测点包括M41L、K70R、K103N、Y181C和T215，并在两步MS-PCR基础上，设计比野生型引物长的突变型引物，结合微孔板杂交ELISA呈色技术检测各点突变。结果显示，简化的两步MS-PCR能保持灵敏度和特异性高的优点，ELISA的阳性结果与阴性结果的比值（P/N）达到要求，两步MS-PCR结合ELISA方法灵敏度高，操作简单、结果直观、成本低、相对耗时短且能进行高通量检测，其无论在HIV-1耐药性突变及其它的点突变检测中具有较好的临床应用前景。
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  累积番茄红素的大肠杆菌工程菌及其培养条件的研究

  刘敏,李荣贵,杜桂彩,范海

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 47-51.

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  噬夏孢欧文氏菌番茄红素合成相关基因crtE, crtB, crtI同时克隆进表达载体pET-15b构建pET-15bcrtIEB，将该重组质粒转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌,IPTG诱导工程菌累积红色色素，经HPLC和吸收光谱分析，工程菌中合成的色素为番茄红素。研究了碳源、金属离子、培养温度、诱导剂浓度、诱导时间等参数对工程菌生长及色素累积的影响，确定了合适的培养条件：培养基为改良LB培养基（蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、麦芽糖5g/L、MgCl2 0.1g/L，NaCl 10g/L）；起始培养温度为37℃；培养至OD600为0.6左右时加入IPTG，终浓度为0.5mmol/L，诱导温度降至30℃；诱导时间为14h。发酵完成后工程菌的生物量（干重）为3.45g/L，番茄红素的最高含量可达5.8mg/gDW。
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  运动发酵单胞菌积累聚羟基丁酸提高乙醇产量

  赖伟坚,陈国强

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 52-56.

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  运动发酵单胞菌是一种很有潜力的酒精生产菌。PHB是生物合成的一种聚酯，有研究表明，该类物质在微生物体内的积累能够提高宿主菌的抗逆能力。本文对运动发酵单胞菌进行了如下改造：将PHB合成操纵子phbCAB与来源于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶的启动子准确融合，插入广泛宿主载体pBBR1MCS-1中，并利用电转化的方法转入运动发酵单胞菌中。在重组菌中检测到了PhaA和PhaB的酶活；并首次在运动发酵单胞菌中实现了PHB的积累。摇瓶实验表明，前48小时重组菌的乙醇积累量提高了约10%，后续发酵中可能由于葡萄糖耗尽，重组菌与野生菌乙醇积累量差别不大。
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  实时PCR分析△5脱饱和酶在花生四烯酸合成中的作用

  肖靓,刘智,朱敏,余龙江,朱路,周蓬蓬

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 57-61.

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  花生四烯酸是人体的必需脂肪酸，具有独特的生物活性。 Δ5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径中催化二高-γ-亚麻酸脱饱和为花生四烯酸的酶。本研究通过实时定量PCR技术，检测了Δ5脱饱和酶在不同花生四烯酸产量的高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株M10,M6和M23中的mRNA表达水平，以及在高产花生四烯酸菌株M6培养过程中的mRNA表达水平的动态变化，发现Δ5脱饱和酶基因的mRNA表达水平与花生四烯酸的产生之间存在明显的线性关系，表明Δ5脱饱和酶是高山被孢霉中花生四烯酸合成途径中起到了非常重要的作用。
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  表面活性剂对绿色木霉产纤维素酶影响

  刘佳,袁兴中,曾光明,时进钢

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 62-66.

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  利用绿色木霉，以稻草为唯一碳源，采用液态发酵的方法，分别加入生物表面活性剂鼠李糖脂和化学表面活性剂Tween 80，重点研究了生物表面活性剂对绿色木霉产纤维素酶的影响。实验分析了加入不同浓度的表面活性剂时滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、微晶纤维素酶活及酶液的表面张力随时间的变化情况。结果表明，添加鼠李糖脂能够促进绿色木霉产酶，分别使滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、微晶纤维素酶活最大提高了1.08倍，1.6倍和1.03倍。与Tween 80相比，鼠李糖脂促进产酶的效果明显优于Tween 80。
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  百日草链格孢菌粗毒素的生产、提取及稳定性的研究

  李荣金,强胜

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 67-71.

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  百日草链格孢菌是从世界性恶性杂草苍耳罹病植株上分离得到的植物病原真菌，研究表明该菌对紫茎泽兰有致病作用，可产生致病的次生代谢产物--毒素。本文对该菌的次生代谢产毒能力情况进行了研究。对培养基条件进行了筛选，确定了有利于该菌产毒的温度为25℃、pH值为6.5、培养时间为9～12天、足够的黑暗以及溶氧、转速等培养条件。利用大规模发酵与发酵产物后提取工艺获取粗毒素并通过分析贮存时间、温度、光照对粗毒素稳定性的影响表明具有开发天然微生物源除草剂的潜力。
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  碳源及温度对食源假单胞菌群体感应信号分子产生的影响

  綦国红,董明盛

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 72-76.

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  许多革兰氏阴性菌通过产生N-酰基-高丝氨酸内酯（AHLs）类信号分子来调控某些性状的表达，即群体感应（quorum sensing）。假单胞菌是一种导致食品腐败的重要腐败细菌，也产生AHLs。本文研究了不同温度及碳源对食源假单胞菌AHLs产生的影响。结果表明，该假单胞菌在25℃条件下，产生两种AHL信号分子，而在4℃条件下，所产生的短链AHL分子消失，主要产生长链AHL分子。而且在不同碳源（葡萄糖，果糖，木糖，麦芽糖等）的培养基中生长，所产生的AHLs分子种类也不同。同时发现当pH>7.5时，AHLs的稳定性下降。由此得出，在不同的环境条件(碳源及温度)下假单胞菌所产生的AHLs种类不同。为进一步研究群体感应现象在食品腐败中的作用以及开发基于干扰腐败菌群体感应的新型食品防腐技术提供研究基础。
技术与方法
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  以可注射性纤维蛋白封闭剂为支架体内构建组织工程软骨

  葛薇,李长虹,邱录贵,赵春华

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 77-83.

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  目的: 研究以纤维蛋白封闭剂（FS）为载体复合人胚关节软骨细胞体内构建可注射性组织工程软骨的可行性。方法:常规分离消化,体外单层培养胎儿关节软骨细胞，观察软骨细胞的生物学特性。分别将1×107、2×107、3×107第4代软骨细胞与FS混合接种于裸鼠皮下, 并于第10周取材判断体内形成软骨的能力。结果: 3~4代软骨细胞保持了很高的增殖和分泌基质的能力。软骨细胞与FS的复合物体内接种后各组均可形成软骨样组织块，其湿重、GAG含量随着接种细胞数量的增多而增高，各组之间差异具有显著性（p<0.05）。3×107细胞组GAG含量与正常人胚关节软骨没有差异（p>0.05）。组织切片显示软骨细胞位于类似正常软骨组织的陷窝中，阿尔新蓝染色及II型胶原表达阳性，细胞内富含高尔基体、粗面内质网及大量分泌泡。结论: FS和人胚关节软骨细胞可以作为理想的支架材料和种子细胞应用于可注射软骨组织的构建。
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  两步串联层析法纯化鼠抗人CD80单克隆抗体4E5

  马泓冰,邱玉华,陶然,李文香,徐颖,张学光

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 84-87.

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  采用阴离子交换与凝胶过滤两步串联层析法，纯化了小鼠腹水来源的CD80阻断型单克隆抗体4E5。腹水样品经离心、过滤预处理后，在Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0, 50mmol/L)条件下上阴离子交换柱对目的单抗进行捕集，采用0-0.5 mol/L NaCl浓度分步洗脱；含目的单抗的洗脱馏分再上凝胶过滤柱纯化，用PB缓冲溶液（pH7.2, 20mmol/L）洗脱，获得目的单抗4E5，其生物学活性高、纯度大于95%，抗体总回收率达61%。
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  微生物发酵产辅酶Q10的高速逆流色谱法分离纯化

  曹学丽,徐亚涛,章光明,谢生猛,董银卯

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 88-92.

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  本文首次将高速逆流色谱法应用于微生物发酵液提取物中辅酶Q10的分离纯化，建立了一套可用于其制备分离的逆流色谱溶剂体系正庚烷－乙睛－二氯甲烷(12：7：3.5, v/v/v)。500mg发酵液粗提物经一步制备分离，可得到绝对纯度在98％以上辅酶Q10130mg。比较表明，该方法较传统的硅胶柱层析和结晶相结合的纯化方法在产物纯度、回收率及产率等方面都有一定的优势。
研究简报
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  人分泌型磷脂酶A2(hsPLA2-IIA)基因的克隆、表达及活性鉴定

  殷秀飞,廖玉华,汪家权

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 93-97.

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  目的 为了构建人分泌型磷脂酶A2(secretary phospholipase A2, sPLA2-IIA) 的有效表达系统，本文从胎脾中提取总RNA，采用RT-PCR方法扩增出编码sPLA2-IIA的基因定向地克隆于硫氧环蛋白基因融合表达载体pET32a的TrxA基因3’末端，构建符合读码框的融合表达载体pET32a-sPLA2-IIA。37℃下经IPTG诱导，hsPLA2-IIA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达，表达产物以包涵体的形式存在。包涵体经8M尿素溶解、复性后检测结果显示具有较高的催化活性并呈现剂量依赖关系。结论：以大肠杆菌为宿主，成功表达了hsPLA2-IIA蛋白，为进一步进行hsPLA2-IIA的大量生产和功能研究奠定了基础。
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  乳酸杆菌肽聚糖对小鼠机体免疫功能的调节作用

  苏广伟,孙进,施用晖,乐国伟

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 98-102.

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  以乳酸杆菌肽聚糖腹腔注射方式刺激小鼠，采用Affymetrix MOE430A基因芯片研究了乳酸杆菌肽聚糖对小鼠机体免疫细胞基因表达的影响，结果发现，乳酸杆菌肽聚糖可以刺激免疫调节细胞因子相关基因的表达，释放细胞免疫因子，其可能是通过激活TLR-NF-κB相关信号通路而实现的。
综述
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  小麦高分子量麦谷蛋白亚基序列及其结构与加工品质的关系

  张金锐,刘勇,林刚,何光源

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 103-110.

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  高分子量麦谷蛋白亚基（high molecular weight glutenin subunit，HMW-GS）是小麦种子贮藏蛋白的主要成分，其组成、含量和结构直接影响小麦面粉面筋的弹展性，决定着小麦的加工品质。本文主要对小麦HMW-GS的序列、结构和亚基之间组合形式做了详细的综述，并较系统地讨论了HMW-GS的结构和组成、特点等与面粉的加工品质之间的关系以及如何从定性和定量两方面来影响面粉的加工品质。
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  食品纤溶酶研究概况

  罗文华,郭勇

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 111-114.

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  溶栓疗法是血栓性疾病安全有效的治疗手段，开发安全高效、廉价的新型纤溶酶对于预防与治疗血栓性疾病具有重要意义。近年来，在许多亚洲传统发酵食品中如日本纳豆、韩国大豆酱、中国豆豉、发酵虾酱等中均发现有丰富的纤溶酶资源。本文重点介绍传统发酵食品中纤溶酶的研究概况及其开发前景。
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  免疫传感器用于堆肥复杂系统监测的研究进展

  章毅

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 115-122.

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  随着免疫测定技术与传感技术的发展以及堆肥法在固体废物处理中的日益受重视,将免疫传感器从环境监测中细化到堆肥化过程中的监测,实时、在线测定,具有现实意义.本文将堆肥复杂系统组分按其物理性质,分为固相、液相、气相三类,着重介绍免疫传感器在其中的应用和发展状况, 综述了近年来用于痕量有害物质检测的免疫传感器的最新研究成果,并探讨了免疫传感器在环境监测中的应用和发展方向。
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  干扰素在哺乳动物早期胚胎发育中的作用研究进展

  齐冰,何新,常正尧,陈清轩

  中国生物工程杂志. 2006, 26(08): 123-126.

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  干扰素是由多种细胞产生的可溶性糖蛋白，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。但是越来越多的实验结果表明干扰素在哺乳动物胚胎植入子宫、怀孕的维持以及早期胚胎发育中发挥着重要作用。本文将结合本实验室的研究工作对干扰素的作用机制和近年来这一领域的研究进展做一综述。