2006年, 第26卷, 第01期　
刊出日期：2006-01-25

  

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研发动态
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  专利

  张树庸

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 0-0.

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研究报告
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  内部结构可控的大体积三维细胞支架制备研究

  陈际达,刘伟,崔磊,曹谊林

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 1-5.

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  目的：研究一种可以控制三维细胞支架内部孔隙结构的实验技术，用于制备孔隙结构可控的三维细胞支架，以满足组织工程对支架孔隙结构的要求。方法：均匀混合粘结剂与致孔剂，在离心力作用下去除混合物中多余的粘结剂，应用溶剂浇注/颗粒沥析方法制备三维细胞支架。结果：致孔剂粘结块的结构非常均匀，粘结程度可以通过实验条件控制。例如，直径为100~220μm的致孔剂，在离心力为161g，粘结剂浓度分别为20％和40％时，颗粒间粘结程度分别为33.78±556 (134)μm和42.89±5.87 (132) μm。并且，利用该技术制备的三维多孔支架，其内部孔隙大小取决于致孔剂颗粒大小，孔隙间的通道直径取决于致孔剂的粘结程度，即离心粘结与溶剂浇注/颗粒沥析技术相结合，能够方便地控制三维支架的孔隙结构。例如，当粘结程度为33.78±556 (134) μm时，支架的通道直径为33.34±5.21(12)μm，两者之间无显著差异。 结论：利用离心粘结与溶剂浇注/颗粒沥析技术结合，获得了孔隙呈球形、孔隙间完全连通的、结构均匀的大体积三维细胞支架，并且支架的孔隙以及孔隙间通道大小均可以实现人为控制。
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  脐静脉和骨髓来源的间充质干细胞的比较研究

  唐晓琼,赵智刚,王红祥,邹萍

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 6-10.

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  间充质干细胞(MSCs)的来源有限，成人骨髓是MSCs的主要来源，这极大地限制了其在实验和临床中的应用。为拓宽MSCs来源，从细胞形态、生长特性、免疫表型和多向分化能力等四个方面对人脐静脉来源和成人骨髓来源的间充质干细胞进行了比较研究。结果表明，人脐静脉来源和成人骨髓来源的 MSCs具有相似的生物学特征，成纤维细胞样形态生长，并具有强大的体外扩增和多向分化能力。人脐静脉来源的MSCs可替代成人骨髓MSCs，作为满足实验和临床需要的重要来源。
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  用差异显示法分析不同生长环境中的造血干细胞/祖细胞基因表达的初步研究

  李群良,刘启威,蔡海波,谭文松

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 11-14.

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  对比分析不同生长环境中的脐血CD34+造血干/祖细胞基因表达变化。方法: 采用静态和动态培养系统培养脐血单个核细胞，1周后收获CD34+造血干/祖细胞, 提取总RNA, 用差异显示法对比分析在不同生长环境中造血干/祖细胞基因表达的差异。 结果: 在所使用的差异显示条件下，得到30个差异表达基因片段，其中一个差异表达片段为RAN基因，该基因属于RAS癌基因家族，可能与造血细胞增殖有关。结论: 不同生长环境影响CD34+造血干/祖细胞的基因表达，这些差异表达的基因可为优化体外培养环境，扩增造血细胞提供分子基础。
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  中空纤维灌注培养模拟骨髓造血研究

  张海玲,张永富,杨少光,田征

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 15-21.

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  采用细胞工程技术探索造血细胞体外扩增技术以维持其自我更新潜能，抑制过度分化。方法：首先建立微载体基质细胞体外造血模型（G1组，即瓶培养模式），设置单纯微载体基质细胞培养（G2组）和单纯骨髓细胞液体悬浮培养（G3组）作对照。检测各组粒系巨噬系造血祖细胞集落产率（CFUGM/105）。自行设计1对引物，以检测Balb/c小鼠原始造血细胞ckit基因mRNA表达水平。试用中空纤维模拟血管灌注功能（Gh组，即中空纤维灌注模式），以G1、G2、G3作对照，并对各组培养效果进行评价。结果：微载体基质细胞体外造血模型实验结果显示：小鼠骨髓细胞培养2周后，CFUGM/105检测G1组比G3组高7.7倍（P<0.05），是2个对照组（G2+G3）集落产率总和的1.9倍。原始造血细胞ckit mRNA表达水平：模型G1组比G2组高3.7倍，比G3组高62.3倍，且差异均显著。在成功建立微载体基质细胞体外造血模型基础上进行中空纤维灌注培养实验，CFUGM/105检测显示：Gh组比G3组高4.6倍，并且略高于G2组；Gh组与G1组集落产率差别不明显。在原始造血细胞ckit mRNA表达水平上Gh组最高，从Gh、G1、G2到G3依次呈下降趋势。结论：在没有外加细胞因子的条件下，微载体基质细胞和中空纤维灌注造血模型可抑制造血干、祖细胞过度分化与耗竭，维持其ckit较高的表达水平。
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  HIV-1整合酶蛋白的可溶性表达及功能研究

  程绍辉,马晓慧,何秋红,刘斌,陈尉祖,王存新

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 22-26.

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  HIV1整合酶是HIV病毒复制中一个重要的酶，也是治疗艾滋病药物的一个重要靶点。为了开展以整合酶蛋白为靶点的抑制剂筛选，构建HIV1整合酶重组质粒，在原核细胞中进行可溶性表达和功能研究。通过重叠PCR技术引入F185K和C280S突变于HIV1 B亚型标准株的整合酶cDNA片段中，PCR扩增片段克隆到pET28a(+)表达载体中，构建重组质粒，在E. coli中进行整合酶基因表达，SDSPAGE鉴定表达产物，亲和层析纯化蛋白，酶联免疫吸附实验方法测定整合酶的生物学活性。结果构建的重组质粒获得高效稳定的可溶性表达，ELISA实验证实该蛋白具有整合酶的3′切割DNA和5′链转移的活性。HIV1整合酶蛋白的可溶性表达和活性研究为建立以整合酶为靶点的抗HIV药物筛选平台打下了基础。
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  一种抗菌肽和aFGF融合蛋白的构建和表达

  丁长才,苏志坚,王艳萍,周权男,李校堃,李校堃

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 27-37.

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  利用PCR技术扩增出带有凝血酶Xa因子切割位点的天蚕素蜂毒素杂合肽和aFGF的融合基因，插入大肠杆菌表达载体pET-3c中,构建出表达质粒pET-aF-CM，并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,氨苄青霉素抗性筛选重组转化子。IPTG诱导4h后，以包涵体形式表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的17%。将包涵体溶解后透析复性，并利用肝素亲和层析纯化，得到电泳纯的融合蛋白。Western blot分析表明，该蛋白能与aFGF抗体产生免疫反应。MTT法检测显示，融合蛋白具有促3T3Bal/b细胞分裂活性，其比活为1.471×106IU/mg。利用凝血酶Xa因子裂解融合蛋白，可以获得抗菌肽和含凝血酶Xa因子裂解序列的aFGF蛋白。分子筛回收含杂合抗菌肽，抑菌活性检测表明其对大肠杆菌K12D31具有明显抑菌活性。微量稀释法检测结果表明，回收的抗菌肽对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌K12D31、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌的MIC分别达6.25μg/ml、10μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml和5μg/ml。
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  家蝇变形期抗菌蛋白的提取

  曹小红,闰仲丽,王春玲

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 33-37.

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  目的:分离纯化家蝇变形期体内抗菌蛋白并分析其抑菌作用。方法:对家蝇（Ｍusca domestica）5日龄幼虫进行针刺诱导，并于24h后挑取变形后的蛹，通过研磨、调酸、加热提取蛹体内的耐热水溶总蛋白，经过两步CMsepharose F.F.离子交换层析分离，以金黄色葡萄球菌作指示菌，检测其抑菌活性，并用SDSPAGE不连续电泳检测蛋白质的分子量。结果:经两步离子交换分离后，得到一种对金黄色葡萄球菌具有较强抑菌活性的蛋白，经SDSPAGE检测为单一条带，其分子量为43kDa。结论:家蝇处于变形期时，经过诱导后体内能产生一种抑菌活力较强的蛋白质。
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  产甘油假丝酵母产甘油关键酶基因在酿酒酵母中的表达

  赵有玺,饶志明,沈微,方慧英

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 38-41.

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  甘油是一种极其理想的耐高渗透压介质。利用PCR方法，从产甘油假丝酵母WL2002-5中扩增出了2个产甘油的关键酶基因GPD和GPP，分别编码3-磷酸甘油脱氢酶（glycerol 3-phosphate dehydrogenase, GPD）和3-磷酸甘油磷酸酶（glycerol 3-phosphate phosphatase, GPP）。利用T-Vector在Escherichia coli JM109中克隆得到大量的GPD和GPP基因，并成功构建了重组质粒pYX212-GPD和pYX212-GPP；通过LiAc转化法将重组质粒导入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1A。初步实验结果表明：发酵过程中pYX212-GPD/S. cerevisiae W303-1A的生物量高于pYX212-GPP/S. cerevisiae W303-1A和野生型S. cerevisiae W303-1A；发酵72h后，pYX212GPD/S. cerevisiae W303-1A发酵液中甘油含量大约为12mmol/L，明显高于野生型S. cerevisiae W303-1A的甘油含量，而pYX212-GPP/S. cerevisiae W303-1A与野生型S. cerevisiae W303-1A在甘油含量上相差不大，均只有4mmol/L 左右。
技术与方法
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  两种标记方法对60mer寡核苷酸芯片背景信号影响的初步分析

  张亚莉,马文丽,莫小阳,石嵘,李凌,徐秋林,张海燕,郑文岭

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 42-45.

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  研究两种不同的样本标记方法对人全基因组高密度60mer寡核苷酸芯片背景信号的影响。收集5对患病与健康人外周血单个核细胞，分别提取总RNA后，采用限制性显示技术（restriction display，RD）进行样本双色（Cy3/Cy5）荧光标记，与5张Agilent 60mer高密度（22K）Human 1B寡核苷酸芯片进行杂交。芯片全部杂交点分3组：基因探针组、阳性对照组和阴性对照组。阳性对照采用荧光标记寡核苷酸直接掺入法进行标记。对全部杂交信号点的Cy3和Cy5背景信号值，用SPSS软件进行数据转换、正态性检验、方差齐性检验、变异系数分析和重复数据的方差分析。数据分析结果显示，Cy3 标记的背景信号值均高于 Cy5标记的背景信号值。重复测量数据的方差分析表明，在Cy3 和Cy5标记中，两种不同标记方法间的背景信号值的差异极显著（PCy3＜0.01, PCy5＜0.01），且RD标记点的背景信号平均值低于荧光标记寡核苷酸直接掺入标记法标记的阳性对照点。RD标记方法是一种有用的低背景信号的高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法。
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  超声和高压对牛血清白蛋白结构的影响比较

  罗昭锋,瞿鑫,沐万孟,时青,张毅

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 46-49.

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  目的：研究牛血清白蛋白经过超声和高压处理前后的结构变化，以及自由基清除剂对其结构变化的影响。为进一步研究细胞破碎和乳化蛋白时超声和高压处理对蛋白的影响提供参考。方法：将BSA溶液经过超声和高压处理，然后利用高效液相色谱（HPLC）、动态光散射（DLS）、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（nondenaturing SDSPAGE）以及园二色谱（CD）等手段检测处理前后的结构变化。结果：发现超声使BSA严重聚集，加入自由基清除剂可以减少聚集的产生。而高压处理后的BSA未出现聚集，但二级结构发生了变化。结论：超声和高压这两种处理方法对蛋白损伤机理不同，所以选择合适的破碎方法要根据蛋白自身的性质而定。
研究简报
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  重组人胰高血糖素样肽－1的表达及生物学活性

  黄静,徐进,左翼,徐伟东,吴自荣

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 50-55.

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  将人工合成的人胰高血糖素样肽-1（human glucagonlike peptide-1, hGLP-1）基因插入质粒载体pET-32a(+)中，构建成rhGLP-1与硫氧还蛋白（thioredox）及六聚组氨酸（hexahistidine）的融合表达载体pET32-GLP-1，转化大肠杆菌BL21（DE3）获得表达菌株，经IPTG诱导发酵的菌体超声破碎后，裂解液用Ni离子亲和层析纯化得到融合蛋白，经肠激酶裂解，再次Ni离子亲和层析，得到rhGLP-1样品。经SDSPAGE 和等电聚焦检测，样品纯度大于90％, 等电点介于pH5.2～pH5.85之间。质谱测定rhGLP-1分子量为3 355.0kDa，肽图分析得到2 097.7kDa和1 005.5kDa两个胰蛋白酶酶解片断，均与理论分析结果一致。动物实验表明重组蛋白具有明显的降血糖活性和促胰岛素分泌作用。
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  压力作用下面包酵母胞内谷胱甘肽和麦角固醇的变化

  乔长晟,贾士儒,刘伯宁,徐旭

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 56-59.

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  以高纯空气（O2∶N2 ＝21∶79）为加压介质，研究了0.5Mpa压力下面包酵母CICC1447和CICC1339细胞生长及细胞内谷胱甘肽、麦角固醇的含量变化。结果表明：加压培养时两株酵母菌的对数生长期延迟出现，对数生长期的持续时间缩短，而且两株菌的比生长速率均明显低于对照组，同时两株菌的倍增时间也较对照组有所延长；压力刺激可显著提高面包酵母细胞内谷胱甘肽（GSH）的含量，但麦角固醇含量的变化却不明显。在0.5MPa压力下保压培养3h时CICC1447胞内谷胱甘肽含量比常压对照组提高了42.6%，而加压3h后麦角固醇含量比对照组提高了20.1％；加压培养6h时CICC1339胞内谷胱甘肽含量较对照组提高了58.7%，但其麦角固醇含量反而降低。这说明不同的酵母菌对压力刺激的反应是不同的。
综述
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  萜类生物合成的基因操作

  黄瑛,曾庆平

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 60-64.

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  萜类是一组结构迥异的化合物家族，其中很多具有较大的应用价值，如青蒿素和紫杉醇等，它们在多种微生物和植物中合成，但其天然产量低。萜类代谢工程通过DNA重组技术改造萜类合成细胞中的代谢途径，以提高萜类最终产量或在不含萜类的生物中合成萜类，为促进有用萜类合成提供了新的机会。以萜类化合物生物合成途径的基因转移与表达为切入点，综述了目前在微生物及植物中应用代谢工程提高萜类产量的研究进展。
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  哺乳动物精子性别特异膜蛋白的研究进展

  王栋,王振铃,程金华,朱化彬,郝海生,刘永华

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 65-68.

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  在精子形成过程中，存在性染色体特异基因的表达，这是X、Y精子膜蛋白差异形成的基础。尽管精子形成过程中形成的细胞间桥可能使精子细胞间共享基因表达产物，但雄性传递偏移现象和性别偏移现象的发生又证明两类精子间存在非共享蛋白，同时H-Y抗原表位的成功鉴定、精子分离实验结果以及性别特异蛋白的检测结果都肯定了精子膜蛋白差异的存在，只是这种膜蛋白的差异很小。蛋白分离技术的进步及技术间的优化集成，为精子间细微差异膜蛋白的分离提供了可能。
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  酿酒酵母吸附重金属离子的研究进展

  陈灿,王建龙

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 69-76.

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  重金属污染成为当今最重要的环境问题之一。生物吸附法是处理大体积低浓度重金属废水的一种理想方法，近年来有关的研究报道不断增多，但尚未实现工业化应用。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不仅是具有实用潜力的生物吸附剂，也是研究重金属生物吸附机理的良好材料。结合自己的研究成果，总结了酿酒酵母作为生物吸附材料的优点、研究中的表现形式和吸附性能，重点讨论了酿酒酵母生物吸附机理，介绍了等温吸附平衡模型和动力学模型在酵母生物吸附中的应用情况。最后提出生物吸附进一步的研究方向。
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  RAPD分子标记在食用菌研究中的应用

  吕长武,吕杰,陈恒雷,曾宪贤

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 77-80.

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  RAPD分子标记以其简单、快速、经济等优点正在被广泛应用于食用菌的研究中。RAPD分子标记克服了传统的标记手段和形态分类学的缺点，在食用菌种质的鉴定和遗传多样性研究，在亲本和杂交种的鉴别以及在基因克隆与分离和遗传图谱的建立等研究中都起着重要的作用。RAPD分子标记为食用菌的深入研究提供了强有力的工具和手段，其应用和发展前景广阔。
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  Red重组技术研究进展

  张全,高会杰,佟明友

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 81-86.

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  主要从Red系统组成元件、作用机理、重组策略以及先进性和发展前景四个方面综述了利用Red 重组系统敲除或替换细菌染色体目的基因的方法。首先简要介绍了传统的细菌染色体重组技术，指出了其中的缺陷。然后提出了Red重组技术的定义：利用噬菌体Red系统介导来实现外源线性DNA片断与细菌染色体的靶基因进行同源重组的方法，外源线性DNA通常是PCR产物、寡核苷酸片断等，在它们的两翼各含有与染色体靶基因两翼同源的序列40~60bp。这种Red重组技术省去了体外DNA酶切和连接等步骤，使细菌染色体靶基因的敲除与替换操作相对简单，逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。
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  毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用

  张伍魁,范清林,宋礼华

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 87-91.

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  巴斯得毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统作为一个日臻完善的外源蛋白真核表达系统由于它所具有的一些其它表达系统不可比拟的优势而得到越来越广泛的应用。分别从该表达系统的优点、外源基因整合及调控机理、表达蛋白糖基化及翻译后修饰等方面综述了其在外源蛋白表达中的研究进展及应用。
产业发展
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  全球生物制药产业发展态势

  文淑美

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 92-96.

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  传统化学制药的黄金时代结束，新化学药品数量下降，而生物技术药物已成为当今最活跃和发展最迅速的领域。随着基因组和蛋白质组研究的深入，越来越多与人类疾病发展相关的靶标被确定，生物制药将有更多的机会获得突破性进展。综述了全球生物制药产业发展的几个态势，主要有：（1）全球生物制药产业的研究成果数量增长迅速；（2）生物制药依然是生物技术产业的重点领域，生物技术药物市场发展规模逐渐扩大，市场集中度高，主要集中于美国和大的跨国公司；（3）生物技术新药在新药研发中的比重越来越大，逐渐成为新药研发主流；（4）生物制药企业间通过加强联盟，来增强新药研发能力和降低新药研发成本；（5）各国政府均重视生物制药产业的发展，出台一系列相关政策。（6）生物疫苗、基因工程药物和基因药物具有良好的市场前景。
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  形成和确保代际优势：美国生物技术产业集群的发展和组织状况

  李志能,苑波,陈波

  中国生物工程杂志. 2006, 26(01): 99-99.

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  美国的生物技术产业已在世界上形成了代际优势。产业集群是美国生物技术产业组织的主要形式。美国生物技术产业集群模式的四大核心特征是，世界一流的研究机构是前提，风险投资网络是关键，新创企业是首要，龙头企业是支柱。这些集群依托巨额的联邦基础研发投入、及时规范的立法、实力超群的资本市场和竞合充分的产业氛围等国家竞争优势，已经为美国今后继续确保生物技术产业的代际优势奠定了基础。