酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblastgrowth factor,FGF-1)是成纤维细胞生长因子家族重要的成员之一。来源于三个胚层的细胞都能够表达FGF-1,其生物学效应非常广泛,在组织和器官发育、血管发生、血细胞生成、肿瘤发生和伤口愈合等方面发挥着重要作用。FGF-1不但可以在细胞外通过胞内信号通路而且也可以进入细胞内部发挥生物学功能。主要综述FGF-1信号转导方面的研究进展、促细胞增殖作用的可能分子机制以及将来的临床应用前景。
间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的成体干细胞,在体内外不仅可以被诱导分化为中胚层细胞,而且可以分化为内胚层和神经外胚层细胞。间充质干细胞易分离,体外可大量扩增,异体移植不引起免疫排斥反应,在细胞治疗和组织工程中具有广阔的应用前景。经过适当诱导,间充质干细胞可能成为胰岛β细胞的来源之一。就间充质干细胞的生物学性状和优势,以及诱导分化为胰岛β细胞的技术方法和发展趋势进行了综述。
与传统的灭活或活体疫苗相比,由基因工程重组抗原或化学合成多肽组成的现代疫苗往往存在免疫原性弱等问题,需要新型的免疫佐剂来增强其作用。尽管传统的铝盐佐剂是目前唯一全球公认的人用佐剂,但存在激发细胞免疫应答能力差等不足,因此,需要研发更为安全有效的人用新型佐剂,尤其是安全无毒、能够刺激较强细胞免疫应答的佐剂,以及适合粘膜疫苗、DNA疫苗和癌症疫苗的免疫佐剂。分析阐述了新型佐剂研究状况和佐剂发展方向,并进一步对新型佐剂的临床前和临床试验研究以及已批准上市的新型疫苗佐剂进行了综述。
转基因动物的迅速发展使医药、农业、环保、生物材料等领域发生了巨大变革。综述了国际和国内转基因动物在这些领域中的研究历史、现状和产业化进展,同时也预测了转基因动物应用的发展前景以及给社会带来的深远影响。
土地盐渍化是农作物产量降低的一个重要因素。从盐分对植物的伤害、植物耐盐的机理、耐盐相关基因的克隆及转耐盐基因植物等方面论述了植物的耐盐机理及转耐盐基因植物的研究现状,分析了耐盐性状的复杂性,并对前景进行了展望。
芸薹属是十字花科植物300多个属中最为重要的一个属,是我国栽培面积最大的蔬菜作物。拟南芥和芸薹属在十字花科中两者的亲缘关系最近,通过它们之间的比较作图,两者之间的共线性被大量发现。模式植物拟南芥全基因组测序已经完成,这为芸薹属作物的基因组研究提供了便利条件。芸薹属作物的功能基因组学能够进一步明确不同发育时期基因的功能,为解释芸薹属的进化提供基因证据。就芸薹属植物在比较基因组学、功能基因组学最新进展,特别是芸薹属与模式植物拟南芥在基因组之间的相互关系进行了综述。
自然界中存在许多具有土腥味的化合物,以Geosmin和MIB为代表,它们的嗅阈值极低,即便含量极微,也能嗅到浓烈的土腥味、土臭味、泥土味和霉味。这些土腥味挥发性物质主要是放线菌和藻类的次生代谢产物,不同生物具有不同的合成途径。它们极易影响饮用水的品质,也给渔业和食品业带来极大危害。通过物理、化学和生物处理等方法,可以控制或清除土腥味化合物,其中微生物降解法是最有应用前景的净化方法。综述了土腥味化合物的来源、生物合成途径、分析检测技术及净化方法。
分别从pMD18-T质粒和人基因组DNA扩增出人apoA-I CDS区序列和apoA-I启动子(702bp片段),与pEGFP-N1重组,构成受apoA-I启动子调控的pEGFP-N1质粒和融合蛋白表达质粒,分别转染人肝癌HepG2细胞,以绿色荧光为标志筛选稳定转染系列克隆。用RT-PCR、荧光显微镜、免疫荧光术等鉴定其中一个克隆融合蛋白的表达;分别以胰岛素和葡萄糖刺激物鉴定该克隆的外源apoA-I启动子调控。结果表明:人apoA-I分泌型表达调控肝细胞模型初步建成。
采用Red系统介导的同源重组方法对含有鼠β-酪蛋白基因的RPCI23-440C1BAC进行快速改构。首先通过PCR方法,获得两端带有鼠β-酪蛋白基因同源序列的tPAm-Zeo同源重组片段,然后将此同源重组片段电击转化至已含有编码Red重组酶质粒的RPCI23-440C1BAC菌中,在λRed重组系统的帮助下,通过同源重组片段两端与RPCI23-440C1中β-酪蛋白同源的序列在菌体内与β-酪蛋白基因发生同源重组,将其置换。最后利用Zeocin抗性基因两侧的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将抗性基因剔除。经Southern blot和序列分析鉴定表明,获得了重组正确且无编码两种重组酶质粒的tPAm-RPCI23-440C1BAC克隆。
利用PCR技术扩增出人免疫缺陷病毒HIV-1MA4-CA融合基因,将其克隆到pGEM-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为450bp,与已发表的HIV-1的全序列基因(AF324493)完全同源,编码一个含150个氨基酸残基的蛋白质。将该基因与分泌型表达载体pCAMBIA1305.2连接,同时将水稻中富含甘氨酸蛋白的信号肽序列(GRP)引入MA4-CA融合基因,构建了含MA4-CA基因的植物分泌表达载体pCAMBIA1305.2-MA4-CA。
构建FS315C末端肽原核表达载体pGEX-FS315C,表达重组人卵泡抑素315(FS315)C末端肽,制备抗FS315C末端抗体。实验结果显示,重组pGEX-FS315C表达质粒在E.coli BL21中高表达GST-FS315C融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化GST-FS315C免疫家兔,获得抗FS315C末端抗体,Western blot检测显示该抗体只与FS315结合,而与FS288无交叉反应。ELISA检测显示抗FS315C末端抗体与FS315特异结合,而与FS288、inhibin及activin A等蛋白均无交叉反应。利用该抗体进行的免疫组化染色显示巨噬细胞FS表达阳性,与以往报道一致。实验采用重组GST-FS315C免疫家兔,成功地制备了抗FS315C末端特异抗体。
动物rRNA基因是一种GC含量较高、结构复杂的重复序列。该研究结合亲缘生物法生物信息学技术,经反复摸索后选用LA PCR法即LA PCR Taq酶结合GC缓冲液来扩增鳜鱼复杂的rRNA基因重复序列,经测序鉴定最终克隆了鳜鱼的3个rRNA基因及其2个间隔序列。分析了鳜鱼与相关动物的rRNA基因序列的同源性和进化关系。探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用、循环参数的调整等措施。
目的:分离卡波氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma,KS)差异表达基因,并建立相应的cDNA文库,为从分子水平揭示KS发病机制打下良好的基础。方法:采集KS肉瘤及来源于同一患者的正常皮肤组织,抽提总RNA,经逆转录酶合成dscDNA,并经RsaⅠ酶切,与2种不同的接头衔接,分别以正常组织和肿瘤组织作为tester和driver,进行双向抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH),初步筛选KS肉瘤与正常皮肤差异表达基因,将差异基因PCR扩增,产物与pGEM-Teasy克隆载体连接,转化DH5α大肠杆菌,采用蓝白斑筛选,获得白色阳性克隆菌落,并煮沸破菌,PCR扩增出未知基因片段。结果:差减得到差异基因片段多位于200~500bp,成功构建了2个分别代表在KS肿瘤组织中表达上调和下调的基因文库。结论:经双向抑制性差减杂交获得了KS差异表达基因文库。抑制性差减杂交是一种快速、方便、有效的建立差异基因文库的方法。
成功构建了腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)高表达的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETNHM(Kanr),研究了重组质粒pETNHM在重组菌株中的质粒稳定性。结果表明,pETNHM具有较好的结构稳定性,连续传代60代后质粒的基因序列没有明显缺失,且能够正常表达腈水合酶。pETNHM具有分离不稳定性,在无抗生素选择压力下,连续传代48代后质粒丢失的无质粒细胞开始出现。琼脂糖凝胶电泳定量分析表明,2/3的质粒pETNHM以二聚体形式存在,导致质粒拷贝数的下降。进一步研究表明,重组细胞的连续高速分裂及腈水合酶的高表达也会造成质粒拷贝数的下降,从而降低其分离稳定性。反之,重组菌株相对于宿主菌株的较高比生长速率有利于保持含质粒细胞的生长优势,卡那霉素的选择压力则能够保证质粒的稳定遗传。
采用常规细菌分离方法从土壤中筛选出一株高效絮凝剂产生菌,编号为B6。经过形态学特征、生理生化反应及16S rDNA序列(GenBank accession No.DQ115363)同源性比较鉴定该菌株为恶臭假单胞菌,命名为Pseudomonas putidaB6。对其培养基进行研究,确定其最佳的碳源和氮源,并通过正交试验确定其最佳的培养基成分配比(ρ/gL-1)为葡萄糖15、果糖3、KH2PO41.0、K2HPO43.0、MgSO40.1、NH4NO30.8、(NH4)2SO41.5、酵母汁0.2、NaCl0.1。同时对其培养条件进行研究,确定最佳的培养基初始pH值为8.0、培养温度为30℃、摇床速度为160r/min,以及产絮凝剂的周期变化过程。用高岭土悬浮液对其絮凝条件进行研究,确定培养液最佳的絮凝条件。
将人的PEX基因克隆到表达载体pET-15b上,构建重组工程菌BL21(DE3)/pETPEX。采用5L发酵罐补料分批培养,当菌体密度增长到OD600为35时,用IPTG诱导,PEX蛋白形成包涵体,最终OD600达到90,PEX的表达水平达2.2g/L。包涵体蛋白经过纯化、复性后,获得生物活性。PEX能够有效抑制HUVECs的增殖,加药96h后,20nmol/L PEX对HUVECs生长有77.9%的抑制率;PEX能阻断bFGF诱导的鸡胚尿囊膜血管生成,抑制率为85%;小鼠实验表明,当给药剂量为5mg/kg时,PEX对S180肉瘤有31.4%的抑瘤率(P<0.05)。PEX是一个有效的抑制新血管生成和肿瘤生长的蛋白质因子。
发展了一种在实验室大幅度提高抗体产量的方法,即采用添加2%的去免疫球蛋白IgG的腹水于无血清培养基中的方法,培养杂交瘤细胞,获得了高达3.55 ×106/ml的细胞密度,纯化后获得了135μg/ml的单克隆抗体产量,比通常的用无血清培养的单位体积培养液抗体产量高4倍。对于体外生产单克隆抗体而言,这种方法经济并且易于推广,它的成功是抗体产量提高的一个巨大进步。
为了建立人脂联素球状结构域(gAd)原核高效表达体系,分离纯化gAd并检测其生物活性,从淋巴细胞中提取人基因组DNA,PCR扩增出含有脂联素编码序列的片段,通过T-A克隆的方法克隆入pMD18-T载体中,然后设计适当的引物引入起始密码、终止密码以及相应的酶切位点,把脂联素球状结构域(gAd)基因亚克隆到表达载体pBV220,将序列鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中,用42℃温控诱导目的蛋白的表达;超声破菌,分离纯化包涵体,8mol/L尿素溶解,采用梯度稀释法复性重组蛋白,动物实验测定其活性。结果在大肠杆菌中成功实现了gAd稳定的以包涵体形式的高效表达,表达量约占全菌蛋白的20%,经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分离得到的包涵体具有较高纯度,复性后具有降低家兔血糖和游离脂肪酸的作用。为进一步研究gAd的生物学活性、作用机制奠定了基础。
构建突变人CD59分子(HMCD59)真核表达体系,探讨HMCD59糖基化前后抗补体活性的变化。采用重组PCR定点诱变技术在CD59易于糖基化的位点构建CD59突变基因,克隆入真核表达质粒pALTER-MAX。利用阳离子脂质体将重组质粒和pcDNA3共转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。G418压力筛选稳定转染细胞克隆,检测筛选HMCD59蛋白高表达株。免疫印迹技术(Western blot)检测出HMCD59蛋白分子量约为20kDa。2,7-二羧乙基-5,6羧基荧光素(BCECF)释放实验初步证实HMCD59具有抗补体活性,糖基化后抗补体活性明显降低,为进一步研究糖尿病血管增殖症的发生机制提供了线索。
紫杉烯是紫杉醇生物合成的重要中间体,为在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中建立一个生物合成紫杉烯的代谢途径,克隆了酵母的羟甲基戊二酰CoA(3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A,HMG-CoA)还原酶基因和=牛儿基=牛儿基二磷酸(geranylgeranyl diphosphate,GGDP)合酶基因,并构建了其融合表达载体pGBT9/HG;同时构建了包含紫杉烯合酶基因的表达载体pADH/TS;将这两个表达载体共转化酵母细胞,通过GC-MS分析检测工程酵母的代谢产物,结果表明获得的工程酵母能够合成紫杉烯,即在酵母细胞中建立了一个合成紫杉烯的代谢途径。
目的:探讨腺病毒载体介导的外酶C3转移酶(exoenzyme C3transferase,C3)表达对体外培养的正常或地塞米松处理的人类小梁细胞的作用。方法:构建C3和绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒表达载体(AdC3GFP)。用AdC3GFP转导人类正常或经地塞米松处理的小梁细胞。观察(1)小梁细胞肌动蛋白、粘着斑蛋白(vinculin)、β-链蛋白(β-catenin)的变化;(2)地塞米松能否诱导小梁细胞形成肌动蛋白交联网(cross linked actin networks,CLANs)结构以及AdC3GFP对CLANs的影响。以仅表达GFP的腺病毒载体(AdGFP)作为对照。结果:与对照相比,AdC3GFP转导小梁细胞后3~4d细胞出现肌动蛋白细胞骨架裂解,相应粘着斑蛋白阳性的粘着斑减少和β-链蛋白染色丧失。与非转导细胞相比,AdGFP转导细胞肌动蛋白细胞骨架,粘着斑蛋白和β-链蛋白染色均与非转导细胞类似。经地塞米松处理的小梁细胞形成典型CLANs结构,AdC3GFP可降解肌动蛋白及已形成的CLANs结构。结论:C3基因表达产物可降解小梁细胞肌动蛋白和细胞连接以及由地塞米松诱导的小梁细胞CLANs形成。提示C3基因治疗可能是青光眼降眼压治疗的有效方法。
