动物细胞大规模培养技术是目前生物技术制药产业广泛采用的技术平台,凋亡是大规模培养过程中细胞的主要死亡方式。近些年来,细胞凋亡的形态学特征和分子机制已得到初步阐明,并由此开发出了一系列的细胞凋亡检测和控制方法,为提高大规模培养中的细胞活力发挥了重要作用。
组织工程血管以及组织工程化组织的血管化因目前内皮种子细胞扩增能力和生物活力的不足而受到限制。EPCs(内皮祖细胞)是内皮细胞的前体细胞。在胚胎期,内皮细胞系与造血细胞系来源于血岛内共同的祖先细胞;出生后,EPCs存在于骨髓,并可被转移至外周血,参与缺血组织的血管重建和血管的内膜化。因此EPCs有望成为今后组织工程内皮种子细胞的重要来源。
细胞外基质材料的开发是骨组织工程的重要组成部分,目前,在骨组织工程中应用较多的基质材料可分为天然衍生材料、人工合成材料以及这两种材料的复合材料。介绍了各种天然衍生骨材料如煅烧骨、脱钙骨基质、脱蛋白骨基质、重组合异种骨基质和天然高分子材料如胶原、纤维蛋白、几丁质、藻酸盐及其衍生物以及珊瑚衍生骨在骨组织工程中的应用,展望了骨组织工程细胞外基质材料的未来发展方向,认为未来的理想基质材料应该是集各种材料的优点于一身,能够充分适应体内各种生理环境并能采用智能化的加工方式进行大批量生产的生物仿生材料。
基因的重新编程对基因的正确表达、胚胎的发育和个体的生长都起着重要作用。目前,哺乳动物克隆成功率仍非常低,其中一个主要原因就是供核基因没有得到正确的重新编程。综述了正常胚胎形成和发育以及哺乳动物克隆中的重新编程事件,并阐述了相关的可能机制。
Fas(CD95)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员。在肝脏中,Fas激活的凋亡信号可能对调节肝细胞动态平衡起作用。但在很多炎症情况下,肝脏Fas的表达水平增高。在多种临床肝病发展过程中,肝损伤与Fas表达和细胞凋亡相关。因此通过对Fas表达进行调控,从而控制肝脏中过量和异常的细胞凋亡,是一种极具潜力的保护肝脏的治疗途径。反义寡核苷酸技术已被广泛用于在许多组织中抑制特定基因的表达。用反义寡核苷酸抑制肝脏Fas表达,可以保护动物避免由细胞凋亡而造成的肝损伤以及爆发性肝炎死亡。讨论了Fas在几种肝脏疾病中的病理作用和利用反义寡核苷酸技术阻止和控制这类肝脏疾病的病变。
人类基因组计划的完成标志着生命科学已经开始迈进后基因组时代,大规模基因的功能研究正成为生命科学研究的热点。基因功能的分析方法日趋成熟和多样化,综述了基因敲除、反义技术、“dominantnegative”策略(“显性失活”策略)、基因诱导超表达、RNA干涉以及生物信息学等基因功能分析策略的特异性及其优缺点。
综述了近年来国内外柑橘生物技术的研究进展,主要涉及到以下4个方面:(1)组织培养(包括胚培养、胚珠培养、胚乳培养、花药培养和营养器官培养)与快繁、脱毒和种质资源保存;(2)原生质体培养、再生和融合及体细胞杂种在柑橘砧木及接穗品种改良中的应用;(3)分子标记技术在柑橘遗传多样性检测、基因定位、亲缘关系分析及体细胞杂种鉴定等方面的应用;(4)转基因技术。目前,现代生物技术是柑橘传统育种的有效补充,已成为柑橘遗传改良、种质资源创新和科学研究的重要技术。
β1,4内切木聚糖酶(EC.3218)能够以内切方式作用于木聚糖主链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖,因此是木聚糖降解酶系中最关键的酶。木聚糖酶具有很大的工业应用潜力和价值,由于许多工业应用木聚糖酶的单元操作都是在高温下进行的,寻求耐热木聚糖酶作为催化剂是非常重要的。重点介绍了耐热木聚糖酶的特性、分泌表达和结构区域的研究进展。
丁型肝炎病毒(HDV)核酶是小核酶的一种,在分子结构和作用机制等方面都有许多不同于其它核酶的特性。以其晶体结构的揭示为基础,近几年对其立体构型及催化机制方面的研究取得了很大进展,尤其是发现HDV核酶的胞嘧啶侧链在生理条件下能发挥一般酸碱催化作用(generalacidbasecatalysis),引起了极大关注。对HDV核酶结构和催化机制的研究,将使核酶被有目的地改造,并极大地推动它在应用方面的研究。
根据产酸期烷烃代谢分析和底物质量平衡,针对使用Candidatropicalis生产十三碳二元酸反应体系,建立了热带假丝酵母在产酸期的代谢动力学模型,并对模型进行了数据拟合和实验验证。采用该代谢动力学模型,首先估算出在以烷烃为单一碳源的培养条件下,烷烃对二元酸的最高理论摩尔转化率为64%,最高理论质量转化率为85%,在此基础上,进一步提出补加其它碳源是提高烷烃转化率最为有效的措施。
近年来,基因芯片技术的诞生使得在一个实验中就可以同时对成千上万个基因进行转录水平的表达和DNA同源性分析成为可能。该项技术已被应用于揭示许多微生物体的转录表达和基因组的差异,随着越来越多的微生物基因组全序列测定的完成,基因芯片正逐渐成为许多微生物学研究领域中的一项常规技术。归纳了该技术在微生物生理,致病性,流行病学,生态,进化,代谢工程及发酵优化等研究中的应用。
以虹彩病毒(iridovirus)感染大黄鱼的脾组织、对虾白斑杆状病毒(whitespotsyndromebaculovirus,WSBV)感染中国对虾的肌肉组织为材料,采用一种简便、快速的方法获得了可满足病毒PCR检测的高质量模板DNA,分别以针对虹彩病毒、WSBV的特异性引物进行PCR扩增,均能有效扩增出预期的条带。与常规DNA病毒模板制备方法相比,具有简便、快速、提取率高、无污染等优点,尤其适用于水产动物病毒PCR检测试剂盒的商品化开发及生产实际应用。
采用一种新的PCR定点诱变技术成功地对野生型水蛭素Ⅲ进行了定点诱变,这种方法快速、简便,有效。通过突变,将野生型水蛭素Ⅲ分子的活性功能非必需区的指状结构顶端第33～36位的氨基酸残基替换为RGDS序列,并进行了高效分泌表达,表达产物分泌到细胞外发酵液中。改构的水蛭素突变体与野生型水蛭素Ⅲ相比,两者的抗凝血酶活性基本一致,但体外抗血小板凝集试验结果表明,前者除原有的抗凝活性外还具有显著的抗ADP诱导的血小板凝集活性,该研究为水蛭素Ⅲ分子的结构功能关系研究以及新型抗凝药物的研制打下了基础。
通过运用流式细胞光度术检测细胞凋亡;运用细胞化学方法检测凋亡相关基因蛋白的表达以及Westernblotting分析等方法来研究抗癌药莪棱舌草Ⅱ号对人肺癌细胞(A549细胞)凋亡的诱导作用。结果表明药物能够诱导A549细胞发生凋亡,凋亡率近40%;药物作用可以使细胞中凋亡抑制基因bcl2表达减少,而凋亡促进基因Bax表达增加。提示诱导肿瘤细胞凋亡可能是莪棱舌草Ⅱ号抑杀肺癌细胞的机制之一。
通过PCR方法使抗菌肽AD基因中带有XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点序列,再克隆到表达载体pPICZαA中,重组表达载体转化GS115,经重组酵母菌表达的抗菌肽AD,其N端去除了其它氨基酸。对重组抗菌肽培养条件进行优化,在YEPD中含葡萄糖2%,pH为75,重组酵母菌培养30h后,05%甲醇诱导42h,杀菌效价达1843,是改造前的31倍。最后重组抗菌肽经CMcellulose23柱层析得到纯化。
用高保真PCR法分别从中国狼山鸡基因组DNA中扩增出卵清蛋白基因(ov)的5′和3′调控区,将其克隆入pGEMT载体,经序列测定证明与已发表的ov基因相应区域无差异。将上述调控序列插入黏粒载体,构建成鸡输卵管特异表达载体pOV。再将lacZ报告基因克隆在上述载体5′调控区的下游,获得的重组载体命名为pOVlacZ。用脂质体包裹的pOVlacZ注射产蛋鸡,RTPCR检测结果表明lacZ基因仅在注射鸡输卵管的膨大部表达,不能在肝、脾、肾、心等组织表达。在上述组织中,仅输卵管膨大部能检测出β半乳糖苷酶活性(1167mUml),注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用(1533mUml),重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中(1733mUml)。结果表明,克隆的鸡ov基因调控区能有效驱动报告基因在输卵管的特异表达,构建的载体能用于鸡输卵管生物反应器的研制。
成功建立了实时荧光PCR鉴定检测转基因玉米GA21品系的方法。该方法通过GA21玉米品系的OTPmEPSPS边界的270bp和133bp靶序列,设计品系特异性检测引物和探针,同时针对Pactin1mEPSPS边界的430bp靶序列设计品系特异性检测引物,应用实时荧光PCR和PCR技术,特异性检测GA21玉米品系。结果表明,应用实时荧光PCR的TaqMan探针技术检测转基因作物边界序列,不仅可以达到品系鉴定的目的,而且该方法和常规PCR比特异性强,简便快速,同时实验采用完全闭管检测,又降低了污染机会,为转基因作物的品系鉴定检测提供了新方法。
采用花粉管通道法将bar基因导入籼稻品系E32,得到对除草剂Basta具有抗性的转基因水稻。遗传分析表明外源bar基因在受体植株后代中呈单基因显性遗传,在世代间可以稳定遗传。目前已分离出抗性稳定的株系。
通过20%(wv)的琼脂糖凝胶和5%(wv)的聚丙烯酰胺凝胶电泳对小麦白粉病抗、感特性品种基因组DNA的RAPD检测结果表明:5%聚丙烯酰胺凝胶对线性DNA分子(01～20kb)和长度相差100bp以下的DNA分子的分离较20%的琼脂糖凝胶电泳效果好。因此,我们研究出了一项利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测小麦白粉病抗、感特性的新技术,在工作中建立了一种适合于检测小麦基因组DNA结构差异的电泳方法。该方法主要包括:(1)丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的新配比;(2)分离DNA片段的最佳凝胶浓度;(3)电泳条件;(4)脱色、漂洗、银染、显色过程。实验发现,该技术对于小麦白粉病抗、感特性检测中的小片段和长度相差100bp以下的线性DNAPCR扩增结果的分辨效果较好。应用该技术在抗感品种间已经发现了DNA水平上的差异。
研究了β环糊精(βCD)、羟丙基β环糊精(HPβCD)对α淀粉酶活性的影响,结果表明βCD能明显稳定α淀粉酶活性,延长其储存时间(4℃)。而HPβCD能明显增加酶的荧光,说明其能更好地与芳香类氨基酸结合,但对酶的储存活性无明显延长作用。
