神经管畸形(neural tube defects, NTDs)是胎儿期中枢神经系统发育异常的先天性出生缺陷,我国部分省份发病率高达19.9‰^[1],已经成为导致新生婴儿先天畸形和残疾的重要原因之一。神经管闭合是精密调控的动态过程,当受到环境或者遗传因素的影响,会引起神经管畸形发生^[2,3,4]。近年来研究证明,糖尿病、肥胖及活性氧等因素是神经管畸形发生的潜在因素,而这些因素均与解偶联蛋白2(uncoupling protein 2, Ucp2)有关^[5,6],故Ucp2成为NTDs的候选基因。Lupo等^[7]和本课题组的研究均显示Ucp2 3'-非翻译区的插入/缺失多态性可能是神经管畸形危险因素 ^[8]。但是Ucp2与神经管畸形的具体关系尚不清楚。 进一步研究Ucp2与NTDs发生的关系及探索其中的机制,首要问题是揭示其在神经管发育中的表达及定位。核酸探针已被广泛用于筛选检测基因,地高辛(digoxigenin, DIG)因其灵敏度高、特异性好、无放射性危害等优点近年来成为核酸探针的常用标记物^[9],目前还未见DIG标记Ucp2 RNA探针的相关报道。本课题利用RNA聚合酶在转录过程中将DIG-11-dUTP掺入RNA产物制备DIG标记的Ucp2 RNA探针,并通过全胚胎原位杂交技术检测小鼠胚胎组织神经管发育中Ucp2 mRNA表达情况确定探针的效果,此探针的成功制备将为后续研究提供检测Ucp2基因的高效手段。

1.1.1 动物 C57小鼠,20~25g体重, 12~15周,购自山西医科大学动物实验中心。

1.1.2 主要试剂 T7 RNA polymerase、SP6 RNA Polymerase购自Promega公司,DNA RNA labeling Mix(DIG-11-dUTP)购自Roche公司,PCR Master Mix购自Tiangen公司。

1.2.1 制备 cDNA 模板 收集小鼠胚胎脑组织,Trizol试剂提取总RNA,并用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA 的完整性。使用 TaKaRa公司反转录试剂盒反转录成cDNA,将反转录的 cDNA 保存在-20℃。

1.2.2 Ucp2引物设计、反转录 Ucp2探针引物设计:根据小鼠Ucp2基因的cDNA序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/22228)设计引物,F-UCP2-1:TTGGTTTCAAGGCCACAGAT;R-UCP2-1:GAGATTGGTAGGCAGCCATT;F-UCP2-2:CCAACAGCCACTGTGAAGTT;R-UCP2-2:GCTGCTCATAGGTGACAAACA。预计 UCP2 -F2/R2 扩增得到的探针模板长度为850bp。

巢式 PCR 反应体系如下:

第一轮PCR反应:2×Mastermix (Transgene) 10μl、7μl 超纯水、1μl F-UCP2-1 和R-UCP2-1引物(5μmol/L)和 1μl cDNA。

第二轮PCR反应:2×Mastermix (Transgene) 10μl、7μl 超纯水、1μl F-UCP2-2 和R-UCP2-2引物(5μmol/L)和 1μl 第一轮 PCR 反应的产物。

PCR 反应条件:95℃变性 5min, 95℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 1min,35个循环,72℃延伸10min。

1.2.3 PCR扩增片段克隆至 pGEM-T Easy 载体、并转化、表达 将 PCR 扩增的目标片段与 pGEM-T Easy 载体连接。连接的反应体系如下:2×Rapid Ligation Buffer 2.5μl、T4 连接酶 (TaKaRa) 0.5μl、pGEM-T Easy 载体(Promega)0.5μl、扩增产物 1.5μl。室温放置1h。将5μl连接产物加入到 100μl的感受态菌(Trans5α)中,冰浴 30min,42℃水浴 1min,冰浴 2min,加入125μl LB培养基,37℃震荡培养45min。涂板,37℃倒置培养 12~14h。

1.2.4 阳性转化菌落测序鉴定 每个平板挑取的多个转化菌落首先进行PCR鉴定。PCR反应体系同上。反应条件为95℃ 2min,94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min共35个循环,72℃延伸 10min。琼脂糖凝胶电泳鉴定结果,阳性转化子进行测序鉴定。

1.2.5 DIG-Ucp2 RNA 探针体外转录制备 制备探针模板:用质粒小提试剂盒(Generay)提取测序正确的阳性菌液质粒,并将质粒命名为pGEMT-Ucp2,插入方向为 SP6 方向。以 pGEMT-Ucp2 作为模板进行 PCR。PCR 反应体系为:2×MasterMix(Transgene)10μl,超纯水7μl、 UCP2 -F2、UCP2-R2 1μl,T7(SP6)引物1μl,5μmol/L模板1μl。 反应条件为 95℃变性 2min、 94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min,循环35次,72℃ 延伸10min。PCR clean up(Axygen)试剂盒收集线性化模板。

体外转录制备探针:使用 RNA体外转录试剂盒(MAXIscript SP6/T7,Ambion,USA)转录上述纯化后的模板。按试剂盒说明书依次加入10×Transcription buffer 2μl、10mmol/L UTP 0.6μl、10mmol/L CTP 1μl、10mmol/L ATP 1μl、10mmol/L GTP 1μl、10mmol/L DIG-11- UTP 1μl、T7RNA polymerase mix(SP6/ T7)2μl、模板 DNA 11.4μl,混匀、离心,37℃水浴1h。接着加入DNase I (Ambion,USA)1μl,37℃水浴15min。然后加入3倍体积的无水乙醇(分析纯)、DEPC 水30μl和无核酸酶的3mol/L醋酸钠(pH5.2)5μl,混匀置于-80℃过夜。次日4℃ 12 000g离心 20min,弃上清,晾干沉淀,20μl 无核酸酶超纯水重悬。

1.2.6 小鼠全胚胎原位杂交Ucp2在E9.5、E10.5的表达 处死妊娠母鼠,获取Ed9.5、Ed10.5小鼠胚胎,浸于PBS配制的4%多聚甲醛(PFA)中, 4℃固定过夜,按常规标准步骤操作^[11]。对照组用正义Ucp2探针,与实验组同时进行。

通过基因工程方法构建重组质粒pEGMT-Ucp2作为表达DIG-Ucp2 RNA探针的模板,利用UCP2-F2和UCP2-R2引物对转化菌提取质粒进行 PCR鉴定,结果M为 Marker(Trans 2K Plus DNA Marker),泳道1~8为引物UCP2-F2和UCP2-R2扩增结果,从图1中可以看出,第2、4转化子为阳性克隆,在850bp附近呈现单一条带,与预期结果相符。选择2泳道的阳性重组子菌液携带的质粒进行测序分析,Blast比对显示序列正确无误(序列信息参见NM_011671)。

利用SP6、T7 RNA聚合酶在体外转录合成掺入DIG-11-dUTP的单链反义及正义Ucp2 RNA探针,经纯化后进行琼脂糖凝胶电泳,结果表明探针的完整性较好(图2),经紫外分光光度计测定DIG-Ucp2 RNA探针浓度为1 488.03ng/μl (OD_260/280=1.98)。

通过小鼠全胚胎原位杂交检测,反义探针检测到Ucp2在E9.5天和E10.5天的胚胎中主要表达在脑组织的前脑、后脑、中脑和神经管发育部位,正义探针未能检测出Ucp2 mRNA的表达(图3)。

NTDs是发生在中枢神经系统的严重先天性出生缺陷,阐明其发生发展的分子机制,需要首先明确相关基因在神经管闭合过程中的表达情况,因此原位杂交技术在NTDs中显得尤为重要。全胚胎原位杂交技术不同于一般在载片上对细胞或组织切片进行探针杂交检测的原位杂交,而是对完整胚胎进行杂交检测,从而在整体上观察探针的结合部位,因此核酸探针具有更明显的优势^[11]。核酸探针最早使用放射性同位素进行标记,虽具有敏感性高、特异性好、分辨力强等优点,但是制作成本高、半衰期短,而且有放射性危害,需要专门的实验室和相应的防护措施,限制了其应用。生物素标记探针具有高灵敏度,但是由于生物样品中常含有内源性生物素及生物素结合蛋白,检测时会发生非特异性结合,影响实验效果,在检测生物样品中应用受限。地高辛标记探针检测法因具备特异性好、敏感度高、无放射性危害、操作简便、结果稳定等优点,近年来得到广泛应用^[12]。

UCP2属于线粒体解偶联蛋白家族,是位于线粒体内膜上的一类载体蛋白,参与能量代谢、活性氧产生、胰岛素分泌调节和脂肪酸代谢等功能活动^[13,14]。本课题组与国外同行对人群中Ucp2 3'-非翻译区插入/缺失多态性与NTDs的关系进行了一些研究,但是Ucp2在神经管畸形发生中的作用报道不多。为此本研究以小鼠胚胎为研究对象,设计制备了DIG标记的Ucp2 RNA探针。根据Ucp2 mRNA全长核苷酸序列设计引物,利用反转录PCR获得Ucp2 cDNA片段,通过基因工程成功构建体外转录合成Ucp2 RNA探针的模板——重组质粒pEGMT-Ucp2,经PCR和测序鉴定表明Ucp2序列正确。然后利用体外转录体系,通过SP6、T7 RNA聚合酶转录生成DIG-11-dUTP掺入的正义、反义DIG-Ucp2 RNA探针。本研究所制备的反义探针具有特异性高、信号强等特点,能高效检测神经管发育的关键时期E9.5d、E10.5d的Ucp2基因表达情况,正义探针无结合,可作为阴性对照,此结果与相关文献报道一致^[15]。

本研究利用地高辛标记核酸探针,成功制备了DIG-Ucp2 RNA探针,有效检测胚胎神经管发育关键期Ucp2在前脑、后脑、间脑及神经管部位的高表达,为进一步研究Ucp2在NTDs中的作用机制提供了有力的手段和工具。