中性粒细胞蛋白酶抑制剂elafin毕赤酵母表达系统的建立及活性检测

中国生物工程杂志

研究报告

中性粒细胞蛋白酶抑制剂elafin毕赤酵母表达系统的建立及活性检测

王晓龙周向东

重庆医科大学第二临床学院信阳师范学院生命科学学院

Inhibitor of Neutrophil Proteinases　Elafin Expression in Pichia pastoris and Activity Investigation

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摘要： 中性粒细胞蛋白酶抑制剂elafin是中性粒细胞弹性蛋白酶特异性抑制剂。为建立中性粒细胞蛋白酶抑制剂elafin毕赤酵母表达系统，通过逆转录PCR扩增获取elafin cDNA,双酶切后定向克隆至穿梭质粒pPIC9K上。SalI酶切线性化后，电穿孔法转至毕赤酵母GS115菌株中，PCR筛选出阳性克隆，接种至最小甘油缓冲培养基中，甲醇诱导表达后，取上清阳离子交换层析纯化靶标蛋白。分别以western-blot、弹力纤维蛋白-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组elafin免疫原性、抗蛋白酶活性。重组elafin在毕赤酵母系统中呈分泌性表达，产量及活性高，分离纯化简便。此表达系统的建立为其后续研究及临床应用奠定了基础。

关键词： 纯化; 毕赤酵母; 中性粒细胞蛋白酶抑制剂; 表达

Abstract: Elafin is a specific inhibitor of neutrophil elastase.To establish expression system of neutrophil proteinases inhibitor elafin in Pichia pastoris ， Elafin cDNA was obtained by reverse transcription PCR(RT-PCR).With restricted enzyme digestion,gene of interest was cloned into shuttle vector pPIC9K.Then the construct was linearized and transformed into Pichia pastoris competent cells by electroporation.Selected positive clone was inoculated into buffered minimal glycerol(BMG)culture media.Add 100% methanol to a final concentration of 1.0% every 24 hours to maintain induction.At several different time points, transfer 1ml of expression cultrure to centrifuge to analyze the expression level by Coomassie-stained SDS-PAGE.Concentrated supernatnat was loaded onto a S6 column using a chromatographic system to purify secreted reconbinant elafin(rec-elafin).Rec-elafin immunogen and activity against proteinases was investigated by western blot and elastin-PAGE respectively. The rec-elafin expression level was up to 12 mg/L.Secreted elafin in Pichia pastoris was easily purified by one-step cationic exchange chromatography and retained its activity.

Key words: expression purification Pichia pastori neutrophil proteinases inhibitor

收稿日期: 2006-06-26 出版日期: 2006-12-25

通讯作者: 王晓龙

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王晓龙,周向东. 中性粒细胞蛋白酶抑制剂elafin毕赤酵母表达系统的建立及活性检测[J]. 中国生物工程杂志, .

. Inhibitor of Neutrophil Proteinases　Elafin Expression in Pichia pastoris and Activity Investigation. China Biotechnology, .

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https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/ 或 https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/Y2006/V26/I12/29

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