目的:探究非催化活性依赖的乳酸脱氢酶A(LDHA)蛋白对乳腺癌增殖、迁移和侵袭的影响。方法:(1)通过将关键残基第105位精氨酸、第138位天冬酰胺、第168位精氨酸和第247位苏氨酸突变为丙氨酸,构建LDHA酶活性缺失突变体。(2)利用Western blot检测LDHA酶活性缺失突变体的蛋白质表达水平。(3)利用试剂盒,通过检测乳酸、ATP和葡萄糖摄取水平验证LDHA酶活性缺失突变体有无酶活性。(4)通过CCK8实验和克隆形成实验检测LDHA酶活性缺失突变体对人乳腺癌细胞增殖的影响。(5)通过细胞划痕愈合实验检测LDHA酶活性缺失突变体对人乳腺癌细胞迁移的影响。(6)通过Transwell侵袭实验检测LDHA酶活性缺失突变体对人乳腺癌细胞侵袭的影响。(7)通过细胞免疫荧光检测LDHA酶活性缺失突变体的亚细胞定位。结果:(1)成功构建LDHA酶活性缺失突变体。(2)LDHA酶活性缺失突变体在乳腺癌细胞中表达,且该突变体无LDHA经典的酶活性。(3)LDHA酶活性缺失突变体促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。(4)LDHA蛋白的酶活性位点突变不影响LDHA蛋白的亚细胞定位。结论:LDHA酶活性缺失突变体促进人乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,且不依赖LDHA蛋白的酶活性,深化了对LDHA在乳腺癌中作用的理解,也为后续研究提供了新的分子靶点和思路。
宠物犬狂犬病、犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感和犬腺病毒病等常见病毒性传染病流行广泛,现有灭活疫苗和减毒活疫苗在安全性、广谱性等方面仍存在局限。为构建针对多病原的广谱候选疫苗,研究基于人工智能(AI)辅助的免疫信息学策略,从狂犬病毒糖蛋白、犬瘟热病毒H蛋白、犬细小病毒VP2蛋白、犬副流感病毒HN蛋白和犬腺病毒hexon蛋白中预测并筛选优势B细胞与T细胞表位,综合AI辅助预测的抗原性、毒性和致敏性指标优选10个表位,串联设计构建多表位抗原BCH和双拷贝抗原2BCH,并基于SV40增强子、CpG基序构建BCH/2BCH的pVAX1疫苗质粒,联合细胞穿膜多肽HNR制剂靶向递送,构建候选DNA疫苗。体外细胞水平实验验证显示AI辅助设计获得的多表位抗原BCH/2BCH可有效表达,能促进小鼠骨髓源性树突状细胞成熟,并显著上调树突状细胞共刺激分子表达;体内以BALB/c小鼠为模型,多表位DNA疫苗能显著影响小鼠IgG水平、脾细胞增殖、细胞因子分泌及CD4+/CD8+T细胞比例,2BCH及CpG/HNR的疫苗制剂可诱导更强的体液和细胞免疫应答,且主要脏器未见明显组织学毒性改变。因此,AI辅助设计获得的针对5株宠物犬常见病毒传染病的多表位抗原在小鼠中具有较高抗原性和初步安全性,该AI辅助的多表位DNA疫苗设计与构建策略可为其他多表位疫苗的设计、优化与保护效力评价奠定基础。
目的:探究温和噬菌体vB_BPM-V3胁迫下普通变形杆菌PV14释放的外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)对奇异变形杆菌CMCC 49005毒力表型及致病性的跨种调控机制。方法:采用超速离心法制备噬菌体胁迫下PV14分泌的OMVs;通过表型实验(运动性、脲酶、生物被膜、环境耐受性)结合RT-qPCR检测受体菌毒力基因(flhDC、pmfA、scsA、sodA)表达;构建RAW264.7巨噬细胞感染模型,评估细菌抗吞噬能力及宿主炎症因子(IL-6、TNF-α、IL-10)表达变化。结果:噬菌体胁迫诱导产生的OMVs不影响受体菌的正常生长动态。该OMVs处理显著抑制了受体菌奇异变形杆菌的迁徙能力并下调flhDC表达,但显著增强了其脲酶活力、生物被膜形成能力(pmfA上调)及对高温、强碱和氧化应激(scsA上调)的耐受性。细胞试验结果显示,OMVs预处理后细菌抗巨噬细胞吞噬能力显著增强,并诱导巨噬细胞呈现高促炎(IL-6、TNF-α高表达)、低抑炎(IL-10低表达)的免疫失衡状态。结论:温和噬菌体胁迫下宿主菌分泌的OMVs作为种间信号载体,通过运动-防御表型转换及免疫逃逸增强策略,提升奇异变形杆菌的环境适应性与致病力。
25-羟基维生素D3(25-OH-VD3)是维生素D3(VD3)的生物活性形式,具有维持人体钙磷代谢、调节人体免疫反应和维持细胞渗透压等生理功能,临床应用广泛。前期研究显示,来源于灰盖鬼伞菌(Coprinopsis cinerea)的过氧化酶CciUPO可实现维生素D3的区域选择性羟基化一步生成25-OH-VD3。为了提高CciUPO的表达量和催化效率,研究以毕赤酵母(Pichia pastoris) X33为宿主,通过信号肽筛选与启动子工程优化CciUPO的异源表达,并构建体外多酶级联催化体系实现维生素D3向25-OH-VD3的高效生物转化。结果显示,使用SPα factor信号肽使25-OH-VD3产量较优化前提升3.23倍(42.85 mg/L)。在此基础上,采用双启动子PAOX1-PDAS2协同调控CciUPO的表达,产物浓度进一步提升至62.21 mg/L。为了提高催化体系的转化效率,进一步优化了多酶级联反应条件。通过调控葡萄糖浓度、葡萄糖氧化酶浓度、助溶剂2-羟丙基-β-环糊精浓度及反应时间,确定它们的最优反应条件分别为25 mmol/L、20 U/mL、45 mg/mL和24 h,最终25-OH-VD3的产物浓度达到101.50 mg/L。研究实现了CciUPO在毕赤酵母中的高效分泌表达,并通过体系优化显著提高了维生素D3的C25位羟化效率,为25-OH-VD3的绿色生物制造提供了新技术路径。
目的:对从尕海盐湖水泥混合样中分离得到的嗜盐细菌MM7进行菌种鉴定和抗菌活性筛选,并对其抗菌活性物质进行分离与鉴定。方法:利用16S rRNA基因序列分析对菌株进行鉴定;单因素法测定菌株的最适生长条件,试纸法或试剂法测定菌株的生理生化特性。以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli) 和白色念珠菌(Candida albicans)为指示菌,采用琼脂打孔法对菌株MM7发酵上清液的抗菌活性进行检测。依次采用乙酸乙酯萃取、酸沉淀、薄层色谱法、硅胶柱层析法、半制备液相、高效液相色谱和凝胶柱层析法等对抑菌物质进行分离,利用96孔板微量肉汤稀释法测定提取物的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC) 。利用高分辨质谱和核磁共振波谱分析与鉴定活性产物的化学结构。结果:经鉴定,MM7菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),其发酵液对6种指示菌均表现出显著的抗菌活性。该菌株在5~55℃、pH 5~14和0%~25% NaCl的范围内均可生长,最适生长条件为37℃、pH 8.0、5% NaCl。菌株的甲基红实验呈阳性,吲哚实验呈阴性等。菌株MM7的发酵液乙酸乙酯提取物和酸沉淀提取物表现出良好的抗菌活性,对6种指示菌的MIC和MBC分别在0.75~3.00 mg/mL和1.50~12.00 mg/mL,且对高温(30~90℃)和酸碱环境(pH 3~11)均具有一定的耐受性。在分离到的组分中,乙酸乙酯提取物中的A4组分和酸沉淀提取物中的B6组分抗菌活性最强。经质谱和核磁综合分析鉴定发现,A4的主要抗菌成分为L-苹果酸;B6的主要抗菌成分为表面活性素-C15(Surfactin-C15)。结论:研究首次从B. licheniformis中分离鉴定出抗菌成分L-苹果酸和Surfactin-C15,并获得了它们对P. aeruginosa等条件致病菌的初步抑菌特性,为嗜盐芽孢杆菌来源的抗菌药物的研发提供了重要参考,同时推动了嗜盐微生物在生物医药领域的资源挖掘与应用进程。
作为转化生长因子-β超家族的重要成员,骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein -2, BMP2)在调控骨骼及软骨组织的发育过程中起关键作用,是目前应用最广泛的蛋白质类骨形成促进因子。但该因子在临床应用中存在半衰期短、易扩散、无法长期作用于体内的缺陷,影响骨修复效果。研究设计了一种携带有溶组织梭菌Ⅰ型胶原蛋白酶(clostridium histolyticum type Ⅰ collagenase, ColG)胶原结合域的BMP2融合蛋白(BMP2-ColG),提高了其对Ⅰ型胶原蛋白的亲和力,增强其靶向滞留能力。由于融合蛋白复性效率较低,且经尿素变性后小分子泛素相关修饰物蛋白(small ubiquitin-like modifier protein,SUMO)酶结构变化影响纯化,在融合蛋白中加入His-SUMO双标签,使BMP2-ColG的表达量达到对照的2.04倍,同时可直接采用Ni-NTA Bead 6FF 重力柱纯化目的蛋白。研究使用冻融法进行融合蛋白复性,且利用SUMO酶在融合蛋白与Ni亲和层析柱结合过程中完成酶切,最终获得无标签的高纯度蛋白质。细胞实验表明,BMP2-ColG具有胶原结合能力,能使人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)的钙沉积结节数显著增多,并上调关键成骨标志物Runt相关转录因子2 (Runx2)和骨钙素(osteocalcin,OCN)的表达。研究结果表明,BMP2-ColG能在大肠杆菌中高水平表达,冻融法有效提高了融合蛋白复性效率,获得的融合蛋白具有胶原结合能力,且能促进关键成骨标志物表达,为BMP2的临床低剂量精准递送提供了新策略。
核心岩藻糖基化是一种重要的N-糖基化修饰,其异常表达与多种癌症的发生发展密切相关,为生物标志物和药靶发现提供潜在靶点。基于质谱的糖蛋白质组学技术为全面分析核心岩藻糖修饰提供了有效的分析手段。由于核心岩藻糖基化肽段相对丰度较低、糖链结构与肽段骨架质谱碎裂行为存在差异、数据解析困难,导致核心岩藻糖修饰的大规模鉴定存在挑战。重点阐述了包括凝集素亲和法与化学酶法等靶向核心岩藻糖基化肽段的富集方法,详细比较了多种质谱碎裂模式,并系统介绍了数据依赖性采集和数据非依赖性采集下的质谱数据分析策略与相关软件工具。此外,还探讨了糖肽定量分析中的挑战与最新进展,以及核心岩藻糖基化在疾病生物标志物研究中的潜在价值。最后,展望了该领域在富集技术、数据分析算法和工具开发等方面的未来发展方向。
中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞是生物技术药物生产的核心底盘细胞。传统工程细胞株的构建主要依赖随机整合(random integration, RI)技术,但该方法存在整合位点不可控、表达异质性显著、遗传稳定性差以及筛选周期长、成功率低等局限性。近年来,随着CRISPR/Cas9等新一代基因编辑技术的突破性发展,使定点整合(site-specific integration, SSI)策略在 CHO 细胞中的实际应用进入新阶段。SSI技术通过将外源基因精准插入预验证的基因组安全港(genomic safe harbors, GSHs)位点,实现了外源基因的长期稳定高效表达,显著提升了外源基因表达的可预测性与遗传稳定性,大幅缩短了细胞株开发周期,提高了工艺开发效率。系统综述了CRISPR/Cas9系统、重组酶系统、转座子系统及其联用策略在CHO细胞定点整合表达体系构建中的最新研究进展,为开发高效、稳定的重组蛋白生产CHO细胞株提供理论依据。
肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)具有独特的病理生理学特征,如弱酸性、高活性氧(ROS)水平、高浓度特异性酶及乏氧等,为智能药物递送系统的构建提供了内在靶点。静电纺丝纳米纤维以其高比表面积、可调的孔隙率和良好的仿生细胞外基质结构,已成为一种卓越的药物载体平台。近年来,将“智能响应”特性与纳米纤维相结合,开发出能感知并响应肿瘤微环境特异性信号的智能响应型纳米纤维,实现了药物的精准、可控释放,并在调节免疫抑制微环境、逆转乏氧、协同治疗等方面展现出巨大潜力。综述了基于不同刺激响应类型(pH、ROS、酶、乏氧、光/热等)的智能纳米纤维的构建策略、释药机制及其在肿瘤微环境调控与治疗中的应用进展,并探讨了该领域当前面临的挑战与未来发展方向。
随着人口老龄化加剧、意外创伤频发,骨、软骨等硬组织的缺损修复重建面临巨大挑战。天然糖蛋白与蛋白聚糖作为细胞外基质的关键组分,在细胞识别、黏附、信号转导等过程中发挥核心作用,但因结构高度异质、分离纯化困难,限制了其在组织工程中的广泛应用。糖肽作为一类新型仿生功能分子,由糖链与肽段共价连接而成,融合了肽段的序列可控性与糖链的生物活性,且相较于糖蛋白、蛋白聚糖合成难度降低,成为骨、软骨等硬组织修复材料的重要选择。综述了糖肽的分类及功能,化学合成、化学-酶促合成及生物合成策略,重点分析了各种方法在构建复杂糖肽方面的优势与局限。进一步综述了糖肽在骨、软骨修复与再生中的应用进展。糖肽材料有望为精准化、功能化的骨、软骨等硬组织再生提供新策略与物质基础。
二硫化钼(MoS2)因其独特的结构和出色的性能,在场效应晶体管(FET)生物传感器领域展示出巨大潜力。系统介绍了MoS2的结构特征和合成方法,探讨了MoS2作为FET生物传感器通道材料的独特性,并详细分析了基于MoS2的FET生物传感器在生物医学传感中的应用进展。最后,对基于MoS2的FET生物传感器面临的挑战和未来发展方向进行了展望。
抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)作为一种具有环境持久性与跨物种传播能力的新兴污染物,其在全球多介质环境中的赋存与扩散已构成重大公共卫生与生态安全挑战。环境基质不仅是ARGs的储存库,更是其通过水平基因转移(horizontal gene transfer, HGT)在微生物群落间扩散的关键枢纽。面对环境样本复杂性高、现场快速筛查需求迫切及传播机制解析困难等挑战,传统监测技术存在显著局限。具有高灵敏度、特异性及微型化集成潜力的生物传感器技术,正逐渐成为环境ARGs高灵敏监测与动态追踪的前沿工具。系统综述了该领域相关的最新研究成果。首先,梳理了应用生物传感器揭示不同环境介质中ARGs分布模式与传播动力学机制的最新研究进展。其次,深入剖析了针对ARG核酸序列的基因型生物传感器,重点阐明了各类等温信号放大策略,以及先进功能纳米材料[如表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering, SERS)基底、上转换纳米粒子、MXene等]在提升光电传感性能和克服基质干扰方面的创新机制。随后,梳理了基因型与表型生物传感器在快速药敏试验及耐药性风险评估中的进展。最后,展望了将复杂样品前处理、微流控技术与便携式终端深度融合的即时检测(point-of-care testing, POCT)趋势,以及集监测与修复功能一体化的智能平台发展方向。
随着生物科技不断向工业领域渗透,工业生物技术作为生物制造产业变革的重要驱动力,推动生物经济的可持续发展。“十四五”期间,我国高度重视生物制造发展。从政策环境、研发进展、创新成果、产业发展、融资热点等角度,对我国生物制造的生物医药与健康、生物化工与材料、生物农业与食品、生物能源与环保四个主要板块进行深入分析,以反映现阶段我国工业生物技术领域发展的新特点、新趋势,同时也为“十五五”期间我国制定生物制造产业发展规划提供参考依据。
