2024年, 第44卷, 第8期 
刊出日期:2024-08-25
  

  • 全选
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    耐药菌新型防治技术与策略专辑
  • 童贻刚
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 1-3. https://doi.org/10.13523/j.cb.2408101
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  • 研究报告
  • 何洋, 李东航, 荆兆元, 杨洪江
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 4-13. https://doi.org/10.13523/j.cb.2311051
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    背景:彭氏变形杆菌是重要的致病菌,其耐药菌株的出现给公共卫生和食品安全带来了严重威胁。噬菌体能杀死病原菌,具有替代抗生素的潜在能力。目的:以彭氏变形杆菌(Proteus penneri)为宿主菌,从淡水鱼肠道中分离得到一株烈性噬菌体phiP4-3,并对其生物学特性、基因组学和分类学进行了研究。方法:使用透射电子显微镜观察噬菌体的形态;通过一步生长曲线和抑菌曲线,分析噬菌体的杀菌效果;通过基因组测序、注释和比较基因组学分析噬菌体的功能和分类。结果:通过透射电子显微镜观察,phiP4-3噬菌体头部直径为98.83 nm,可伸缩尾部长度为55.35 nm。一步生长曲线结果显示,该噬菌体的潜伏时间约为25 min,每个感染中心释放的噬菌体数量约为17 PFU。抑菌曲线结果显示,噬菌体phiP4-3能有效抑制宿主菌生长。基因组测序组装结果显示,噬菌体phiP4-3的基因组长度为167 849 bp,GC含量为31.5%。使用软件对基因组进行注释,发现噬菌体phiP4-3的基因组上共编码270个ORF和8个tRNA基因。综合比较基因组学、分类学及国际病毒分类委员会(ICTV)的分类结果,将其归类为StraboviridaeBragavirus属病毒。结论:分离得到一株新彭氏变形杆菌噬菌体,并对其生物学特性和基因组进行了分析,为噬菌体在公共卫生和食品安全中的应用提供了理论依据。

  • 郭开鑫, 张金城, 倪畅, 沈茫茫, 周昕
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 14-26. https://doi.org/10.13523/j.cb.2403054
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    阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)是一种机会致病菌,有导致鲻鱼等水产动物大量死亡等严重问题。从福建某水产养殖场污水中分离到一株新型裂解性阴沟肠杆菌噬菌体ZX14并对其进行生物学特性及基因组分析,探索ZX14在防治多重耐药阴沟肠杆菌感染的应用价值。噬菌体ZX14能高效裂解阴沟肠杆菌,效价高达1.5×1010 PFU/mL,潜伏期为20 min,爆发量为45 PFU/cell,且在50℃、pH 5~12等环境下具有良好稳定性和适应性。基因组分析显示,ZX14基因组全长173 679 bp,GC含量为39.92%,共编码294个开放阅读框(open reading frame,ORF)和10个tRNA,不含耐药基因和毒力基因,其中122个ORF被注释为功能蛋白。此外,该噬菌体可跨种裂解阴沟肠杆菌、路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)和神户肠杆菌(Enterobacter kobei),并对这三种细菌在体外都显示出高效抗菌活性。研究首次报道了一株可跨种裂解细菌的噬菌体ZX14,该噬菌体具有广阔应用前景,有望为防治多重耐药阴沟肠杆菌感染提供新的解决方案。

  • 满成, 徐士杰, 苑慧欣, 赵焕乐, 刘文华, 邹玲, 尹燕博, 张灿
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 27-35. https://doi.org/10.13523/j.cb.2404053
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    目的:从犬舍环境中分离噬菌体,对其进行生物学特性测定和全基因组序列分析。方法:以96株大肠杆菌为宿主菌,利用双层平板法从犬粪样分离纯化噬菌体;使用透射电子显微镜观察噬菌体形态特征;通过双层平板法测定其裂解谱、最佳感染复数、理化因子耐受性、一步生长曲线及体外抑菌活性,确定噬菌体的生物学特性;通过全基因组测序和分析确定其基因组序列特征。结果:分离到一株Ackermannviridae科噬菌体LHE287,正二十面体头部直径约为86 nm,可收缩尾部呈伞状,长约为107 nm。 该噬菌体不仅可裂解大肠杆菌,还可以裂解沙门菌。当感染复数为0.000 1时,噬菌体效价最高达1.72×109 PFU/mL,且在24 h后仍可有效抑制细菌增殖,表现出良好抑菌效果。噬菌体LHE287在50℃以下,pH 5~10范围内较稳定,对紫外线具有一定抵抗能力。以E. coli 287为宿主菌增殖,其潜伏期为30 min,爆发期为90 min,爆发量为100 PFU/cell。该噬菌体基因组全长为149 485 bp,包含168个开放阅读框和3个 tRNA,无毒力基因和耐药基因。结论:成功分离并鉴定1株Ackermannviridae噬菌体LHE287,表现出良好的应用潜力,将为进一步开发为噬菌体制剂防控犬源大肠杆菌病提供支持。

  • 徐振文, 肖纪滕, 李梦哲, 童贻刚, 虎淑妍
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 36-47. https://doi.org/10.13523/j.cb.2404049
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    目的:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)是临床最常见的耐药病原体之一,研究其噬菌体对治疗由多重耐药菌MRSA引起的细菌感染具有重要应用价值。方法:以一株多重耐药菌MRSA38为宿主菌分离新型噬菌体,分析该噬菌体的生物学特性和全基因组序列,并通过体外试验评价该噬菌体的抑菌效果。结果:从医院污水中分离获取一株能高效裂解MRSA的新型噬菌体,命名为BUCT_X001。透射电子显微镜结果显示BUCT_X001具有正二十面体头部(50 nm)和不可收缩尾部(250 nm)。该噬菌体的生理特性测定结果表明,其最佳感染复数为0.01,潜伏期为15 min,对数生长期为150 min,平均裂解量为54.7 PFU/cell。BUCT_X001具有较强pH稳定性与温度耐受性,在pH 5.0~9.0和温度4~45℃范围内处理后能保持稳定活性。该噬菌体的宿主范围较广,能裂解17株MRSA菌。此外,BUCT_X001的抑菌效果与MOI呈依赖性,即使当MOI仅为0.01时,BUCT_X001仍能在4 h内使培养液OD600值下降到0点附近,并维持效果直到8 h。BUCT_X001的全基因组结果显示,其总长度为42 649 bp,G+C含量为34%,该基因组编码68个开放阅读框。系统发育树结果表明BUCT_X001与CaudoviricetesBronfenbrennervirinae亚科噬菌体SAP_1432序列相似度最高,全基因组覆盖率为61%,序列一致性为97.38%。结论:分离出一株可高效裂解MRSA的噬菌体BUCT_X001,该噬菌体对宿主菌具有较强杀伤效果,有望用于预防与治疗由MRSA引起的细菌感染。

  • 张永记, 陈娅帆, 邵伟, 刘杰, 张维, 李新风, 钟明月, 何进, 杨航
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 48-56. https://doi.org/10.13523/j.cb.2405040
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    目的:分离获得含半透明仔虾病(translucent post-larvae disease,TPD)毒力因子的副溶血弧菌及裂解该弧菌的噬菌体,并评估噬菌体用于防治水产养殖行业弧菌感染的可能性。方法:利用选择平板法和分子生物学技术分离鉴定弧菌菌株,然后通过双层平板法分离获得噬菌体,并对其进行表征和全基因组测序分析。结果:分离到一株含TPD毒力因子的副溶血弧菌VP392和可裂解该菌株的噬菌体BP471,该噬菌体感染宿主菌最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1,潜伏期为20 min,裂解量为181 PFU/cell;在pH 3~11、温度55℃以下、盐浓度50 g/L以下均具有良好的稳定性,可明显抑制宿主菌生长且具有较广的宿主谱;全基因组测序表明其为双链DNA病毒,无毒力因子和抗生素抗性基因。结论:成功分离到一株可裂解含TPD毒力因子的副溶血弧菌噬菌体,其稳定性好、裂解谱广、安全性好,有望作为安全、环保型生物制剂应用到TPD防治中。

  • 陈慧珏, 刘文才, 钱敏桦, 潘灵婷, 徐锦鹏, 李登峰, 童贻刚
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 57-68. https://doi.org/10.13523/j.cb.2404050
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    目的:嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的致病范围十分广泛,耐药现象日益普遍,危害鱼类、家畜和人类健康,有必要分离、鉴定烈性A. hydrophila噬菌体。方法:以A. hydrophila Ah2为指示菌,用双层平板法从污水中分离获得烈性噬菌体Yyong。对其进行了电镜观察、宿主范围检测、一步生长试验、全基因组测序、基因注释和系统进化分析。结果:Yyong呈肌尾病毒样,头部直径为(83±2) nm,尾部长度为(115±5) nm。基因组全长165 663 bp,G+C含量为40.90%,含有16 个tRNA基因和242 个开放阅读框(ORF),含有诸多辅助代谢基因(AMGs),主要涉及DNA合成和抗氧化应激。有2个ORF分别被预测为编码毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)防御系统的毒素(PAAR重复蛋白)和抗毒素DarG,这有利于Yyong在细菌细胞内生存。有3个ORF分别被预测为编码σ因子、抗σ70蛋白和σ70诱饵,这些因子可能修饰RNA聚合酶使之优先识别噬菌体基因的启动子区域。在系统进化树中,与Yyong进化距离最小的病毒是Tulanevirus属的气单胞菌噬菌体。Yyong与它们间分享的最高平均核苷酸一致性(ANI)值和DNA分子杂交(isDDH)值分别是94.51%和53.30%,均小于定义一个种的边界值,与它们间分享的最大成对序列相似度值(PASC值)和基因组间相似度(VIRIDIC)值分别是90.51%和90.20%,均大于属的边界值;Tulanevirus属与Straboviridae科的另一个属Biquartavirus聚成一个枝簇(clade),它们共享的核心基因(core genes)占比为68.53%,符合国际病毒分类委员会(ICTV)关于建立一个亚科的标准(27%~79%)。结论:Yyong是一个新种,属于Tulanevirus属。建议在Straboviridae科下建立一个新亚科以包含Tulanevirus属和Biquartavirus属。Yyong携带数量和种类多样的AMGs和tRNA基因,使其有效地控制宿主细菌,高效合成噬菌体自身核酸和蛋白质。一些AMGs具有良好开发潜力。丰富了噬菌体基因数据库与噬菌体分类系统,为噬菌体功能基因研究和噬菌体研发奠定了基础。

  • 刘亚茹, 满都拉, 陈忠军, 孙子羽
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 69-77. https://doi.org/10.13523/j.cb.2402020
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    对前期分离得到的沙门菌噬菌体PSDA-2基因组进行基因功能分析,发现其尾丝蛋白与鼠伤寒沙门菌的内切鼠李糖苷酶有较高序列相似性,表明该蛋白质可能具有多糖解聚酶活性。对编码该尾丝蛋白的基因进行克隆、异源表达和纯化,得到多糖解聚酶Dpo32。利用苯酚硫酸法和双层平板法分析该多糖解聚酶活性,测定其酶谱及pH、温度、乙醇和金属离子对其稳定性的影响。结果显示多糖解聚酶Dpo32可在较宽温度范围内降解沙门菌表面多糖产生还原糖,在平板上使1株鼠伤寒沙门菌(CICC 21483)裂解,3株沙门菌产生晕圈。稳定性研究结果显示该酶在30~80℃、pH 2~11、≤60%乙醇溶液和≤10 mmol/L的K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+溶液中保持良好活性,表明其具有较高环境适应性。

  • 蔡刘体, 陆宁, 代园凤, 杨颜, 唐军, 陈兴江, 孟建玉, 汪汉成
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 78-84. https://doi.org/10.13523/j.cb.2311035
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    为掌握烟草青枯菌噬菌体ϕPB2的稳定性及其对烟草青枯病的防控效果,测定了温度、pH、盐浓度对其活性的影响,采用离体叶片实验检测了噬菌体对烟草叶片青枯病病斑的防控效果,并通过大田试验检测了田间防控效果。结果表明,噬菌体ϕPB2在低温和室温水体条件下,30~90 d内比较稳定;在pH为5.0~8.0较稳定;离体叶片接种不同浓度噬菌体液,噬菌体浓度越高,防控效果越好;噬菌体ϕPB2菌剂田间防控青枯病,青枯病发病率和病情指数较空白对照明显降低,噬菌体菌剂处理平均相对防控率达到70%以上(2021年)。研究结果为烟草青枯病生物防控提供一种新策略, 为利用烟草青枯菌裂解性噬菌体防控烟草青枯病提供理论依据。

  • 陈鑫茹, 李瑶, 付开来, 王阳, 吴珮榕, 张昱晗, 薛峰, 任建鸾, 戴建君, 汤芳
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 85-96. https://doi.org/10.13523/j.cb.2406015
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    噬菌体作为一种天然裂解细菌的病毒,可用于细菌疾病治疗。旨在筛选出有效治疗小鼠乳腺炎的噬菌体,为奶牛乳腺炎防治提供参考。以实验室保存的金黄色葡萄球菌AA292菌株为宿主菌,分别从污水样、粪样中分离纯化出2株噬菌体,命名为φFJ04、φAH12。对2株噬菌体的生物学特性进行了分析,结果表明,φFJ04最佳感染复数为1,裂解量为149,温度耐受范围在40~50℃,pH耐受范围在3~10, 宿主谱为63/90株;φAH12最佳感染复数为 1,裂解量为448,耐受温度在40℃,pH耐受范围在4~12,宿主谱为28/90株。通过全基因组测序分析,发现φFJ04全长38 540 bp,(G + C)% = 33.79%,含有48个ORF;φAH12全长264 664 bp, (G+C)% = 24.7%,含有282个ORF。φFJ04、φAH12基因组内均不含整合元件、毒力基因和耐药基因,可用于体内治疗。对噬菌体杀菌效果进行评估,发现由φFJ04、φAH12组成的噬菌体鸡尾酒在6 h可以将104 CFU/mL的金黄色葡萄球菌全部杀灭。施用108 PFU/mL噬菌体鸡尾酒对108 CFU/mL AA292所致的小鼠乳腺炎有明显改善作用,能使治疗组乳腺组织细菌载量下降2.8 log10CFU/g,杀菌效果约为99.84%。通过观察HE染色切片发现,治疗组乳腺腺泡结构较为完整,乳腺上皮细胞脱落显著减少,为奶牛乳腺炎防治提供了参考。

  • 技术与方法
  • 陈曦, 闫梅英, 文远汐, 阚飙, 樊粉霞
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 97-104. https://doi.org/10.13523/j.cb.2404052
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    目的:建立一种基于噬菌体特异基因检测霍乱弧菌的TaqMan-qPCR方法。方法:基于VP1噬菌体的特异性基因gp46,建立TaqMan-qPCR方法,根据VP1潜伏期为50~60 min,爆发周期持续110~120 min,确定TaqMan-qPCR体系检测时间点。比对分析基于gp46与基于霍乱弧菌毒力基因ctxB建立的两种TaqMan-qPCR方法。结果:基于VP1噬菌体gp46成功建立TaqMan-qPCR反应,扩增效率接近93%,Ct值与样本中噬菌体浓度的相关系数高达0.998。TaqMan-qPCR和琼脂双层噬菌斑计数两种方法结果一致性很高,偏差低于2.45%。基于噬菌体gp46基因比基于毒力基因ctxB建立的TaqMan-qPCR方法的LB模拟样本灵敏度提高10倍,粪便及环境水体模拟样本灵敏度可提高100倍。结论:成功建立快速、高灵敏度和高特异性的TaqMan-qPCR方法,可实现在几小时内对含有霍乱弧菌疑似样本进行快速检测。

  • 陆思源, 曾宇坤, 周昕
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 105-115. https://doi.org/10.13523/j.cb.2405019
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    目的:通过异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记分离得到的鸡白痢沙门菌噬菌体PC79-13,建立荧光噬菌体检测鸡白痢沙门菌的流程。方法:从污水中分离得到一株鸡白痢沙门菌(Salmonella pullorum)的烈性噬菌体,透射电镜表征其形貌,液体培养宿主后感染测定噬菌体一步生长曲线、热稳定性、pH 稳定性、紫外线稳定性及最佳感染复数,以及利用生物信息学方法分析其基因组,了解其生物学特性和基因特征。最后用FITC标记此噬菌体获得一种荧光噬菌体探针。结果:此株鸡白痢沙门菌噬菌体(命名为PC79-13)可在鸡白痢沙门菌C79-13双层琼脂平板上形成大小均一、清晰而透亮的噬菌斑。电镜观察显示:噬菌体PC79-13头部为直径约60 nm的正二十面体,长尾,属于有尾噬菌体属长尾噬菌体科。以鸡白痢沙门菌C79-13为宿主菌测得该噬菌体最佳感染复数为0.01,一步生长曲线显示噬菌体PC79-13的潜伏期为30 min,爆发期为80 min。此外,噬菌体PC79-13对酸碱环境皆有较大耐受性,pH=7.0为其最适酸碱度。其抗紫外线照射和高温能力也较强。FITC标记的荧光PC79-13,宿主鸡白痢沙门菌C79-13感染滴度有少量损失(小于10%)。荧光标记的噬菌体PC79-13能高效结合鸡白痢沙门菌C79-13及其他3株鸡白痢沙门菌,在荧光显微镜下显示绿色荧光棒状结构。荧光PC79-13不结合实验室保存的4株鼠伤寒沙门菌、4株肠炎沙门菌及52株大肠杆菌菌株。结论:分离到一株特异性裂解鸡白痢沙门菌的噬菌体PC79-13。荧光标记的PC79-13仍然保持特异性吸附实验室保存的4株鸡白痢沙门菌菌株的能力,在暗场显微镜下可见目标沙门菌呈现亮绿色荧光,检测限为10 CFU/mL,检测时间少于20 min。因此,构建的荧光噬菌体快速检测法,有潜力未来应用于临床常见鸡白痢沙门菌快检。

  • 综述
  • 李春艳, 戴宗贤, 李炳娴, 杨延辉
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 116-127. https://doi.org/10.13523/j.cb.2405004
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    由分枝杆菌引发的相关感染仍然是全球重大公共卫生问题,耐药性分枝杆菌的出现使其治疗愈发困难,寻找新的治疗方案迫在眉睫。在抗耐药菌方面,噬菌体的研究已经取得了显著进展。自然界中的噬菌体数量庞大,目前已有超过2 400株分枝杆菌噬菌体的基因组被测序,结果显示分枝杆菌噬菌体的基因组具有丰富的多样性和嵌合结构,其编码的抗结核活性多肽及蛋白质等物质在分枝杆菌感染引起的疾病诊断与治疗中具有巨大应用潜力。在实际应用中,噬菌体既可以直接治疗细菌感染,又可以作为基因编辑的递送工具。此外,噬菌体的特异性使其用于治疗时具有一定的安全性。综述了分枝杆菌噬菌体在疾病诊断、治疗和预防等方面的应用,展望了分枝杆菌噬菌体的应用前景,同时分析了其在基础应用研究中的优缺点。

  • 向愉悦, 唐思敏, 刘英, 陈丽丽, 柏琴琴
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 128-141. https://doi.org/10.13523/j.cb.2405005
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    铜绿假单胞菌是临床常见的条件致病菌,常引起院内感染。该菌抗生素耐药形势严峻,是全球范围内导致耐药相关死亡人数最多的病原体之一。噬菌体能特异性裂解细菌,在控制抗生素耐药铜绿假单胞菌引起的感染方面具有潜在的应用前景。然而,铜绿假单胞菌容易产生对噬菌体的耐受性,影响了噬菌体的实际应用。主要从铜绿假单胞菌耐受噬菌体后的表型变化、耐受噬菌体的机制及目前应对铜绿假单胞菌噬菌体耐受性的主要策略等方面进行综述,为应用噬菌体防控铜绿假单胞菌感染提供参考。

  • 何静怡, 崔泽林
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 142-147. https://doi.org/10.13523/j.cb.2312049
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    细菌耐药性已经非常严峻,防治耐药细菌感染是当下亟须解决的紧迫问题。噬菌体可用于防治耐药细菌感染,如果能更广泛地被用于临床,将会造福更多患者。噬菌体疗法目前仍面临一定挑战。从法律法规伦理、社会接受度、背景明确的噬菌体资源缺乏、制剂制备标准化和质量评估与个体化治疗方案定制五个方面入手,基于国内外噬菌体的临床治疗和研究现状,综合归纳了噬菌体在治疗耐药细菌感染方面所遇到的困难和现有解决方法。

  • 任德志, 李函洋, 徐亚奇, 童贻刚, 段军
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 148-154. https://doi.org/10.13523/j.cb.2404026
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    目前重症医学科超级细菌产生逐年增加,给院内感染防控和公共卫生带来许多新挑战。噬菌体是一种能特异性感染并裂解细菌的病毒,为重症多重耐药菌感染的治疗带来新希望。总结了利用噬菌体进行院内环境消杀与监控、治疗重症感染的案例,并分析了在重症医学科中应用噬菌体的问题与可能对策,为噬菌体在重症医学科中的应用研究提供新思路。

  • 刘自豪, 李俊, 吉星, 魏瑞成, 王冉, 赵延胜, 何涛
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 155-164. https://doi.org/10.13523/j.cb.2312014
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    细菌耐药性已被认为是21世纪人类健康面临的重要威胁之一。接合转移是耐药基因在细菌群落中(尤其是肠杆菌科细菌)水平转移的最重要途径。IV型分泌系统(T4SS)是一个大分子转运系统,由IV型偶联蛋白、内膜复合体、外膜复合体和接合性菌毛组成,T4SS在耐药质粒的接合转移中起关键作用。近年来以质粒编码的T4SS为靶标的细菌耐药性防控新策略不断兴起,就耐药质粒的T4SS分类、结构和分布以及靶向T4SS的质粒依赖性噬菌体(PDBs)进行综述,并提出基于PDBs的耐药性防控策略,以期为耐药性传播的防控提供新思路。

  • 刘文峰, 邓佳程, 李俊桦, 肖敏凤
    中国生物工程杂志. 2024, 44(8): 165-182. https://doi.org/10.13523/j.cb.2405001
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    在当前全球抗生素耐药性和公共卫生安全问题日益突出的背景下,噬菌体作为一种潜力巨大的替代性治疗和防控手段,逐渐引起广泛关注。尽管其应用前景广阔,但噬菌体在实际应用和产业化发展过程中仍面临诸多挑战和机遇。全面总结了国内外噬菌体在农业、畜牧水产、食品工业和人类健康等领域的应用现状及标准化进程,系统梳理了当前面临的问题和实际需求,并提出了系统化的建设方案。此外,还深入分析了噬菌体应用标准化对相关产业发展的推动作用,强调了标准化在提高产品质量和安全性、促进技术创新、整合产业链、增强市场信任度及推动国际合作等方面的关键作用。希望能为噬菌体应用和产业化发展提供全面的指导和规范,助力解决抗生素耐药性危机和提升公共卫生安全水平。