目的:研究白花地胆草(Elephantopus mollis H.B.K)的乙醇提取物EM-3抗肿瘤作用分子机制。方法:MTT、克隆形成抑制和细胞划痕实验检测EM-3对鼻咽癌细胞增殖、迁移能力的影响;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;PI单染检测细胞周期;超速流式分选细胞仪检测鼻咽癌CNE2-S18肿瘤干细胞样SP细胞(side population cell)比例;Western blotting检测细胞凋亡、周期、侵袭迁移及肿瘤干细胞相关蛋白表达变化。结果:MTT、克隆形成抑制和细胞划痕实验结果表明,EM-3可以显著抑制鼻咽癌细胞的增殖,随着药物浓度的增大,细胞克隆数逐渐减少,体积逐渐变小,而且能够显著抑制鼻咽癌细胞的迁移;流式细胞术结果表明随着药物浓度的增加,凋亡率逐渐增加,并且G2/M期细胞比例逐渐增加;超速流式分选细胞仪结果表明,EM-3可以显著降低CNE2-S18肿瘤干细胞样SP细胞的比例;Western blotting结果表明,随着药物浓度的增加,xIAP、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2(药物高浓度)、MMP9、p-Met、Oct4(药物高浓度)及Sox2蛋白表达减少,而Cyclin B1、Bax蛋白表达增多,并伴随Caspase-9、Caspase-3活化及多聚ADP核糖聚合酶PARP酶切失活。结论:EM-3通过抑制Stat3通路诱导鼻咽癌细胞发生凋亡, 并诱导G2/M期阻滞。此外,EM-3经MMPs途径抑制鼻咽癌细胞迁移,同时可以有效降低CNE2-S18肿瘤干细胞样SP细胞干性。
过氧化物氧还酶 6(peroxiredoxin6,Prdx6)是一种双功能蛋白质,具有GSH过氧化物酶和磷脂酶A2活性。前期研究构建布鲁氏菌强弱毒株感染绵羊白细胞层SSH cDNA文库,发现Prdx6在不同毒力布鲁氏菌感染时存在一定的差异性表达,推测Prdx6可能在布鲁氏菌感染中发挥一定的作用。为了更好地研究其在生物体中的作用,以RT-PCR技术,提取小鼠巨噬细胞系RAW 264.7总RNA,反转录制备cDNA,设计特异引物克隆Prdx6开放阅读框核酸序列,并构建原核表达载体,进行原核表达,以镍柱纯化获得纯度较高的Prdx6蛋白,免疫家兔制备高特异性、高灵敏度的鼠Prdx6兔源多克隆抗体,为后续进一步研究Prdx6蛋白功能提供科学依据和应用工具。
目的:研究下调围脂滴蛋白基因(PLIN1)表达对3T3-L1细胞脂解的影响。方法:采用RNA干扰技术,构建3组阳性及1组阴性sh-PLIN1重组载体,并进行菌液PCR和DNA测序鉴定。Western blot测定PLIN1A蛋白表达,评价载体下调效果。细胞转染有效载体2天后,Bodipy 493/503染色脂滴;酶学方法测定细胞中甘油三酯和甘油含量;Western blot检测甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)及其磷酸化蛋白(p-HSL)的表达。酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞中环磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)的浓度。结果:各sh-PLIN1干扰载体构建成功,且3组阳性载体均能显著下调PLIN1A蛋白的表达(P<0.05)。转染有效载体后,与阴性转染组相比,sh-PLIN1转染组细胞中脂滴减小,甘油三酯含量降低,甘油含量升高,ATGL和HSL相对表达量显著升高(P<0.05),p-HSL相对表达量及cAMP、PKA的浓度无显著性差异(P>0.05)。结论:下调 PLIN1 基因表达可加快3T3-L1细胞脂解速率,其可能通过上调ATGL和HSL的表达而实现,cAMP/PKA信号通路对其无明显调节作用。
目的:分析miR-335在多种肿瘤组织与癌旁组织中的表达,预测其靶基因并进行相关生物信息学分析,为进一步研究miR-335在肿瘤中的调控机制提供理论基础。方法:分析miR-335的保守性及在多个肿瘤组织中的表达;预测miR-335靶基因,并使用DAIVID对miR-335靶基因进行生物信息学分析。结果:miR-335序列高度保守,在肝癌、肺癌、乳腺癌、肝内胆管癌、脂肪肉瘤中表达下调(P<0.05)。预测miR-335靶基因共34个,靶基因集合功能富集于细胞迁移、凋亡、转录调控,以及蛋白质分子连接、细胞骨架组成等生物学过程和分子功能(P<0.05);主要参与了轴突向导和黏着斑信号通路、黑素瘤疾病信号通路及TGF-β信号通路(P<0.05)。结论:miR-335在多种肿瘤中表达异常,且涉及多个生物学过程和信号转导通路,与肿瘤的发生发展密切相关。
为研究匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)TP-02中碳代谢阻遏因子CRE对其产纤维素酶的调控特性,从其基因组DNA中扩增得到CRE全长基因,并利用重叠PCR(overlapping PCR)技术将潮霉素B抗性基因(hygB)插入其中,既破坏cre正常转录又提供了筛选标记。通过电转化将pUCm-T-cre-hygB导入匍枝根霉萌发孢子,经抗性筛选得到△CRE突变株。利用RT-qPCR对此突变株纤维素酶基因转录水平进行研究,发现 eg、bg、cbh1和cbh2 的转录均有所提高,分别为48.75%、26%、5.6%和38.6%。同时,△CRE突变株的纤维素酶在表达水平上也均高于原菌,其中内切葡聚糖苷酶酶活提高了58.62%。CRE的破坏在一定程度上减弱了碳阻遏效应,其对纤维素酶的调控具有特异性。其中,对内切酶的调控最为显著。此外,△CRE突变株在3%糖浓度下仍高产纤维素酶,这为后续酶系优化及产业化生产提供了一定的依据。
为制备新的遗传筛选标记用于构建高产番茄红素的工程菌株,实验运用化学诱变的手段,以N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍为诱变剂,以番茄红素生产菌株卷枝毛霉MU616为出发菌株,诱变获得5株尿嘧啶缺陷型突变株,突变株在基本培养基中培养5天后仍不能生长。通过同源转化带有pyrG基因(编码乳清酸核苷-磷酸盐脱羧酶)的质粒pEPM1确定突变株Mt1、Mt4和Mt5为pyrG基因缺陷突变株。随之对pyrG突变株进行生长特性的研究和产番茄红素性能的检测,结果表明,其中突变株Mt4的生物量为(9.0±0.6)g/L,番茄红素产量在黑暗和光照条件下分别为(1 648±185)μg/g和(3 234±281)μg/g,均与出发菌株相似,适宜作为进行卷枝毛霉转化的带有遗传标记的受体菌。pyrG基因缺陷突变菌株的获得对构建高产番茄红素的卷枝毛霉工程菌具有重要的意义。
从南海深海放线菌Pseudonocardia antitumoralis SCSIO 01299中克隆一个脂肪酶基因 lipaseB5。lipaseB5 基因片段大小为972bp,编码的蛋白质具有323个氨基酸残基并与Pseudonocardia sp. HH130629-09中假定脂肪酶有98%的同源性。以pET28a(+)为载体,将重组质粒转化到E. coli BL21(DE3)中,实现lipaseB5高效表达,并利用Ni-NTA 亲和层析纯化lipaseB5。LipaseB5最适反应底物为对硝基苯酚癸酸酯(p-NPD),最适温度为30℃,最适反应pH为7.5。LipaseB5催化p-NPD水解反应的活性达到140.14U/mg,Vmax和Km分别为109.8μmol/min、0.976mmol/L,催化橄榄油的活力为32.019 7U/mg。LipaseB5在pH7.5~8.5保持良好的pH稳定性;在10~20℃低温下保持较高的酶活力,在10~40℃内具有温度稳定性。LipaseB5对大部分金属离子有很好的耐受性,低浓度的Li+、Mg2+对该酶活性有促进作用。LipaseB5对高浓度的NaCl有很好的耐受性,在100mmol/L的NaCl存在下,酶活性大约保持在103%。LipaseB5对多种短链醇类有机溶剂和表面活性剂有很好的耐受性,TritonX-100、Tween-80和Tween-20对lipaseB5酶有激活作用。
核小体是构成真核生物染色质的基本结构单位,组蛋白变体H2A.Z及H3.3对染色质结构及基因转录过程发挥着重要的调控作用。体内研究核小体及染色质结构受到诸多因素限制,体外重构含有H2A.Z及H3.3的核小体结构是研究与组蛋白变体相关基因表达调控的重要方法之一。实验表达纯化了6种组蛋白,在复性的过程中装配了含有H2A.Z和H3.3的组蛋白八聚体。基于DNA序列10bp周期性及序列模体设计了3条易于形成核小体的DNA序列,通过PCR大量扩增的方法,回收了标记Cy3荧光分子的目的DNA序列。采用盐透析法体外组装了含有H2A.Z和H3.3的核小体结构,利用荧光标记、EB染色及考马斯亮蓝染色检测了含有组蛋白变体的核小体形成效率及形成过程的吉布斯自由能变化。结果发现,设计的3条DNA序列可以有效地组装形成含有组蛋白电梯的核小体结构,而且随着组蛋白八聚体与DNA比例的增加,核小体的形成效率显著提高;采用Cy3荧光标记可以灵敏且定量地计算组装过程的吉布斯自由能。该方法的建立对研究组蛋白变体相关的结构生物学及转录调控等具有一定的意义。
目的:旨在建立耐低温革兰氏阴性菌外膜蛋白体外折叠体系,为膜蛋白合成耐低温机制提供理论基础。方法:以包涵体的形式在大肠杆菌中过量表达了来源于耐低温希瓦氏菌的OmpA同源外膜蛋白Omp74的全蛋白质和N端跨膜结构域,纯化包涵体后,用高浓度尿素或强阴离子表面活性剂溶液溶解包涵体,以非离子表面活性剂为折叠介质,建立该外膜蛋白的体外折叠体系,同时以大肠杆菌的OmpA作为对照进行了比较研究。结果:与OmpA相比,Omp74体外折叠受温度影响较小,低浓度的阴离子表面活性剂能促Omp74的折叠,但对OmpA的折叠没有影响;C端结构域抑制Omp74在表面活性剂中的折叠;Omp74在0.5%的月桂酰基麦芽糖苷(DDM)和0.4%的十二烷基肌氨酸钠的混合溶液中能达到接近100%的折叠效率。
探索了电子嗅传感仪直接通过发酵尾气进行发酵液中甲醇浓度在线检测的方法,建立了毕赤酵母表达糖化酶过程中甲醇浓度的自动化反馈补料控制模型,可准确实现发酵过程中甲醇浓度的精确控制;研究表明,当利用电子嗅将培养液中甲醇浓度稳定控制在(890±35)ppm水平下,发酵诱导培养到128h时目的蛋白糖化酶酶活达到了8 153U/ml,与甲醇浓度控制在(350±26)ppm时的发酵水平相比提升了48.8%。该方法具有无需前处理、与发酵液非接触、快速和准确性的优点,为提升工程酵母在工业发酵培养过程工艺的优化控制具有重要的指导作用。
重组抗体药物在抗肿瘤、抗自身免疫病、抗感染等领域都有较好的应用前景,且市场的需求量正在逐年上升。然而许多的抗体药物在研究、生产过程中都面临着产量低、稳定性差、活性低等问题。目前,在大规模制备抗体药物的过程中,常常利用动物细胞表达系统来生产分泌蛋白,而信号肽作为连接在分泌蛋白N端的一段氨基酸序列,能够控制蛋白质的分泌途径进而影响抗体蛋白的表达产量。简要概述了信号肽的一级结构与作用机制,同时,指出其对重组抗体蛋白分泌效率的影响途径,最后结合各种研究成果总结出信号肽序列优化策略。
成纤维细胞生长因子17(FGF17)是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的成员之一,并与FGF8、FGF18组成FGF8亚家族。在胚胎时期FGF17扮演重要角色,对多种组织器官起着重要作用。研究发现,FGF17不仅参与了脑部发育和神经形成,而且参与骨骼、动脉的发育和肿瘤等生物过程。现针对FGF17的特点,及其在胚胎发育、神经系统、癌症等方面的作用进行综述。
TCR基因修饰T细胞的过继性免疫治疗是指将识别肿瘤抗原的特异性TCR基因转导至外周血T细胞,经大量扩增后回输给患者,从而发挥抗肿瘤效应的一种治疗技术。目前TCR基因治疗所面临的关键问题之一是如何改造修饰转TCR基因使得转TCR α链和β链在T细胞表面优先配对以提高转T细胞的功能,并避免off-target反应毒性的产生。最近,各种基因修饰策略被用于优化转TCR基因配对和减少错配。介绍了近年来针对TCR基因进行修饰改造的各种策略及TCR基因治疗的临床试验。
TRAFs家族是一类多功能蛋白,最初是作为TNFR介导的信号通路中的转导分子而被发现的。TRAFs作为信号接头蛋白和调节分子,参与了TNFR、TLRs、NLRs和RLRs等多种受体介导的信号通路。TRAF7是最新发现的TRAF家族成员,因其保守的RING结构域,而具有E3泛素连接酶活性。此外,TRAF7还以其独特机制参与了MAP激酶、TNFR及TLR2介导的信号通路的转导,以及细胞应激、分化和凋亡等重要生理过程的调控,与乳腺癌、脑膜瘤等多种疾病的发生密切相关。结合最新研究进展对TRAF7的结构、功能及其参与的生物学过程进行综述。
半纤维素是一类丰富可再生而又亟待开发利用的生物质资源,将半纤维素降解为糖类进而生产木糖醇及其它化学品是利用生物质资源的关键一步。乙酰木聚糖酯酶是降解半纤维素的一个重要酶,它能够水解乙酰化木聚糖中的木糖残基上的2位和3位的O 乙酰基,在工业、农业及食品业具有广阔的应用前景。综述了乙酰木聚糖酯酶的分类、酶学性质、催化机制、基因克隆和协同酶解等方面的研究进展,同时对该研究进行了展望。
工业真菌是酶制剂的重要生产微生物,其菌种改良具有重要应用价值。综述了产酶工业真菌的应用、突变育种技术进展和高效产酶机制的分析策略,尤其是基于组学水平的基因组、转录组和蛋白质组的分析等,最后总结了高产机制在菌株改良上的应用。
