2012年, 第32卷, 第10期　
刊出日期：2012-10-25

  

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研究报告
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  中介蝮蛇毒纤溶酶基因真核表达载体的构建及其功能的研究

  刘玉芬, 冬黎黎, 孙玉刚, 刘鹏, 陈辉, 赵文阁

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 1-6.

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  目的:蛇毒纤维蛋白溶解酶能直接溶解纤维蛋白或纤维蛋白原,在心脑血管疾病的治疗方面具有潜在的应用价值。方法:采用双酶切技术从pMD18T-FLE I克隆载体上获得中介蝮蛇毒纤溶酶基因编码区,再将其亚克隆到真核表达载体pFASTBACHTa上,经转化、筛选和鉴定,获得重组真核表达质粒pFASTBACHTa-FLE。重组质粒经小鼠尾静脉快速注入小鼠体内,进行瞬时表达。结果:经SDS-PAGE和Western blot检测,表明在小鼠肝脏组织中有重组FLE蛋白表达。免疫组织化学检测证明该蛋白在小鼠肝脏组织中大量表达。纤维蛋白平板法鉴定该重组蛋白具有较高的纤溶活性,其活性呈现出剂量相关性和时间依赖性。因此为进一步对中介蝮蛇毒纤溶酶的应用奠定了坚实的基础。
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  下调CENP-E对乳腺癌MCF-7细胞的影响

  湛晓琴, 胡敏, 宋培培, 章帆, 刘晨, 施琼, 翁亚光

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 7-13.

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  目的:探讨有丝分裂检查点蛋白着丝粒蛋白-E(CENP-E)基因在肿瘤发生发展中的作用。方法:利用shRNA下调CENP-E基因的表达,分别用巢式PCR和Western blot检测CENP-E mRNA和蛋白的表达;MTT检测CENP-E下调后MCF-7细胞的增殖变化;流式细胞术检测CENP-E下调后对MCF-7细胞凋亡的影响;Transwell试验检测MCF-7细胞的迁移和侵袭能力变化;间接免疫荧光检测细胞内CENP-E蛋白和有丝分裂情况。结果:shRNA能有效抑制CENP-E mRNA和蛋白的表达。MTT结果显示CENP-E下调后MCF-7细胞的增殖能力减弱(P<0.05);流式细胞术显示下调CENP-E后能促进MCF-7细胞的凋亡;间接荧光结果显示CENP-E干扰后MCF-7细胞内CENP-E蛋白减少并伴有核分裂异常;Transwell试验显示CENP-E干扰组细胞的迁移和侵袭能力增强(P<0.05)。结论:下调部分CENP-E的表达能抑制MCF-7细胞的增殖,促进MCF-7细胞的凋亡,增强MCF-7细胞的迁移和侵袭能力。
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  GFP工程酵母菌的构建及其对Cu²⁺的荧光响应

  仪民, 吕品, 吴丽华, 仪慧兰

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 14-18.

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  从酿酒酵母基因组DNA中克隆到金属硫蛋白启动子(P_CUP1)片段,将绿色荧光蛋白(GFP)基因置于P_CUP1的调控下,构建重组质粒pCUP9K-GFP,并通过氯化锂法转化毕赤酵母,获得工程菌株。工程菌细胞及其发酵液中可检出GFP荧光,表明P_CUP1能启动外源基因GFP转录,使工程菌表达并分泌GFP。研究发现,工程菌培养液中分别加入10 μmol/L的铜、铬、镉和砷离子后,铜处理组GFP荧光强度明显增加,其余三种离子对工程菌荧光强度影响不大;用铜离子诱导后,工程菌发酵上清液的荧光强度明显增强,并与铜离子浓度(0~1mmol/L) 呈正相关。研究表明,该工程菌中启动子P_CUP1受铜离子诱导,GFP的表达对铜离子具有剂量依赖性,在一定浓度范围内,GFP荧光强度与铜离子浓度呈正相关。
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  转基因水稻克螟稻2号定量检测用质粒标准分子研制及不确定度评价

  李亮, 臧超, 王晶, 隋志伟, 赵正宜, 董莲华

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 19-24.

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  转基因作物的食用安全和环境安全一直受到消费者与各国政府及相关机构人员高度重视。质粒标准分子是转基因核酸量值的载体,为实现转基因植物核酸量值准确性、可比性和有效性提供保障。描述了转基因水稻克螟稻2号质粒标准分子(pKMD2)的研制过程,包括质粒构建、特异性、均匀性、稳定性、可替代性和量值及不确定度评价等方面。量值结果表明pKMD2质粒标准分子所含两个基因片段比值为1.032,不确定度为0.032,可以替代基因组作为阳性标准品用于实验室质控、含量检测及贸易争端等领域。
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  过表达AtchyB基因提高洋桔梗光胁迫耐受性的研究

  关春峰, 武卫党, 季静, 王罡, 金超

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 25-32.

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  类胡萝卜素尤其是叶黄素循环类物质在植物抵抗由强光照引起的非生物胁迫中发挥着重要的作用,为了提高洋桔梗对强光照的抗性,从拟南芥中克隆了类胡萝卜素生物合成途径中参与叶黄素循环关键酶——β-胡萝卜素羟化酶基因(AtchyB),利用农杆菌介导法将其转入洋桔梗中,最终得到遗传转化植株2个株系,研究发现,转基因植株中总类胡萝卜素含量高于对照组,且叶黄素循环池被不同程度地放大。在不同光照强度下, 转基因洋桔梗植株对光照耐受性明显强于对照组,且转基因植株生物量也明显提高。表明过表达AtchyB基因使洋桔梗光胁迫耐受性有所增强。
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  红花microRNAs靶基因的生物信息学预测

  董园园, 李海燕, 李校堃, 杨树林

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 33-38.

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  miRNA是一类动、植物细胞中负责转录后调控的非编码RNA,植物的miRNA通常来源于具有茎环结构的单链RNA前体上,加工成熟后同ARGONAUTE转变成蛋白复合体结构,通过结合并沉默蛋白合成模板的方式关闭完整的基因表达网络。由于miRNA存在组织表达的特异性,且miRNA在植物中的表达高度保守。通过高通量测序获得的红花(Carthamus tinctorious L.) miRNA序列信息与红花转录EST数据库比对,通过靶基因预测筛选,对属于104个家族的173个红花miRNA进行预测,其中得到109个miRNAs对应调控的385个红花靶基因。并且通过Nr基因注释表明多数红花miRNA的靶基因编码包括调控细胞生长发育、信号转导及新陈代谢等相关的功能蛋白。
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  中药半夏单细胞悬浮培养、胚胎发生及植株再生

  欧巧明, 厚毅清, 包梅年, 胡达, 陈玉梁, 岳春玲

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 39-49.

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  以悬浮细胞作为靶标材料,在COLC诱导获得多倍性细胞后,经诱导分化和再生形成纯合的多倍体植株,是一条可行且高效的多倍体诱导途径。但该途径的前提是成熟、高效的单细胞悬浮培养和植株再生体系建立。鉴于此,在获得优良胚性愈伤组织的基础上,对半夏细胞悬浮培养、细胞分化及再生植株所涉及的关键问题及其影响因素进行研究,结果获得了以近圆形细胞为主的高质量单细胞悬浮系,细胞生长曲线呈典型的"S"型,细胞密度可达2.0×10⁶以上,活细胞率可达86.80%,近圆形细胞率可达82.64%;明确了其细胞胚胎发生的两种可能途径,并通过诱导细胞分化,成功获得了愈伤组织增殖,最终实现了高效的植株再生,愈伤分化率可达94.46%,丛生芽诱导率可达337.42%,幼芽成苗率可达90.75%,幼苗生根率可达95.40%,移栽成活率可达98.83%,从而建立了高效的半夏悬浮细胞培养和植株再生体系,为后续的基于单细胞水平的半夏多倍体诱导研究提供技术参考和科学依据。
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  氮源和碳源对解淀粉芽孢杆菌Q-426抗菌脂肽合成的影响

  赵朋超, 权春善, 金黎明, 王丽娜, 范圣第

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 50-56.

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  微生物来源的环状脂肽在生物农药以及医学领域极具应用潜力。通过测量抑菌活性并利用反相高效液相色谱(RP-HPLC),液相质谱联用(HPLC-MS)和串联质谱(MS/MS)技术检测抗菌脂肽组分的变化研究了氮(N)源、碳(C)源和培养基中的初始pH值对解淀粉芽孢杆菌Q-426菌株中抗菌脂肽bacillomycin D和fengycins合成的影响,从而为进一步研究它们生物合成的基因调控以及更有目的性提高产量提供理论依据。结果表明:L-组氨酸、L-赖氨酸、甘油、山梨醇以及培养基中的[OH]^-均能促进脂肽bacillomycin D的合成,但它们在该实验菌株抗菌脂肽bacillomycin D合成途径中的调控靶点有所不同。
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  一株丁二酸高产菌株的筛选鉴定及初步发酵研究

  申乃坤, 秦艳, 王成华, 朱婧, 廖思明, 黄日波

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 57-62.

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  以牛胃内容物为菌源,利用富马酸钠为唯一碳源并加入高浓度丁二酸钠的选择培养基筛选到一株丁二酸产量较高,副产物较少的菌株。经形态学、生理生化鉴定和16S rDNA序列的系统发育分析,该菌株为巴斯德菌科的产琥珀酸放线杆菌,与琥珀酸放线杆菌S.JST序列相似性最高为98.98%,命名为琥珀酸放线杆菌GXAS137,保藏号为M2011399。利用正交试验对发酵条件进行了初步优化,该菌可发酵55 g/L葡萄糖产38.96 g/L丁二酸,具有较好的丁二酸生产潜力。
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  间充质干细胞过滤分离器制备人羊膜间充质干细胞的研究

  王佃亮, 张艳梅, 杜娟

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 63-66.

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  自然存在的间充质干细胞数量少,限制了其研究应用。依靠自主发明的间充质干细胞过滤分离器,分离制备了人羊膜间充质干细胞,并对制备的干细胞进行了三维培养扩增。结果表明,制备的干细胞形态长势良好,并能诱导分化为类胰岛样组织。与常规方法相比,干细胞收获率提高了8倍以上,且细胞活性状态良好。间充质干细胞过滤分离器可以批量制备高质量的各种间充质干细胞,有利于高效率地建设各种间充质干细胞库,以促进间充质干细胞的研究应用。
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  链霉菌A01-chit33CT产纳他霉素和几丁质酶协同表达发酵条件优化

  林振亚, 吴琼, 孙瑞艳, 陈捷, 李雅乾

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 67-73.

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  生物农药由于具有良好的生态效应和安全性,因此比化学农药更受到人们的青睐, 生物农药的发展契合低碳、循环、清洁绿色经济发展理念。因此,寻求利于食品安全和环境保护,同时高效控制植物病害的新型生物农药成为时下及未来研究的热点。链霉菌以产生纳他霉素等抗生素起到生防作用。链霉菌株A01-chit33CT既可以产生纳他霉素又可以高表达几丁质酶活,生防效果大大增加。为确定链霉菌A01-chit33CT产纳他霉素和几丁质酶协同表达的发酵条件,初步探索了碳氮源和发酵条件对菌株产生纳他霉素和几丁质酶的影响。结果表明,葡萄糖促进纳他霉素的产生而抑制几丁质酶的表达,因此分两阶段添加葡萄糖和几丁质粉来达到二者协同表达。研究确定最佳发酵培养基为:葡萄糖 40 g/L,几丁质粉10 g/L(发酵4 d添加),黄豆粉30 g/L, 大豆蛋白胨 10 g/L, CaCO₃ 5 g/L,MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L,K₂HPO₄ 0.5 g/L。最优发酵条件为:初始pH 6.0, 温度28℃,转速180 r/min。在此条件下,链霉菌A01-chit33CT产纳他霉素达1.52 g/L,同时几丁质酶活达990 U/ml,二者比优化前的水平分别提高了1.95倍和2.27倍。
技术与方法
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  骨髓间充质干细胞与聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯生物材料共培养细胞补片的初步研究

  牛红星, 穆军升, 张健群, 胡平, 伯平, 王艳

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 74-79.

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  目的:研究聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯[P(3HB-co-4HB)]这种新型高分子材料与骨髓间充质干细胞(BMSCs)共培养,观察材料对干细胞的存活及增殖的影响,形成细胞补片的效果;从而找到一种适合BMSCs生长、增殖的高分子生物材料,作为治疗心肌梗死,软骨损伤等多种组织损伤疾病的修复方法之一。方法:取清洁级雄性健康BSL-C57小鼠作为实验对象,通过分离培养获得小鼠BMSCs,并进行流式细胞仪鉴定表面标志物。BMSCs培养至5代后,将BMSCs与P(3HB-co-4HB)制成的生物材料薄膜共培养,24h后固定进行电镜扫描,并用DAPI荧光染料染色处理,在荧光显微镜下观察并进行细胞计数,并描绘生长曲线。结果:BMSCs流式细胞术鉴定:CD34、CD45阴性,CD90弱阳性,CD73阳性。扫描电镜下,P(3HB-co-4HB)材料与BMSCs共培养形成的细胞补片,其表面细胞数量多,细胞状态正常。荧光显微镜下,对其细胞补片表面的细胞进行计数,并绘制生长曲线,显示表面细胞有逐渐增多的趋势。结论: P(3HB-co-4HB)材料与BMSCs共培养制成的细胞补片表面有细胞存活及增殖,由于P(3HB-co-4HB)材料本身具有良好的生物组织相容性及可降解等性质,所以该新型高分子材料可以作为干细胞治疗多种疾病的支架材料之一。
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  利用甘蔗糖蜜酒精发酵液生产腐植酸的菌种鉴定及发酵条件研究

  奉灵波, 周瑞芳, 赵辰龙, 陈桂光, 李杨瑞, 李楠

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 80-85.

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  从土壤中筛选出一株适合用甘蔗糖蜜酒精发酵液生产腐植酸的菌株H812。单因素实验和正交实验结果表明,该菌株培养的最适酒精发酵液浓度为16°Bx,最适培养条件为:时间8d、温度34℃、摇床转速200r/min、初始pH7.0、接种量12%和装液量50ml/250ml,其中温度对发酵产品影响显著。在优化的条件下,腐植酸产量为38.12 g/L,较优化前提高了148.34%。对H812菌株进行形态特征分析以及ITS序列分析,推测该菌株为曲霉属真菌。
综述
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  肿瘤免疫逃逸与T淋巴细胞关系的研究进展

  陈海, 毛建平

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 86-92.

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  阐明肿瘤免疫逃逸是防止肿瘤发生、诊断肿瘤发展以及治愈肿瘤的关键。肿瘤逃避免疫监视(immunosurveillance)已知与宿主免疫低下、T细胞无能,和肿瘤抗原缺失和调变、肿瘤漏逸、缺乏共刺激通路信号等相关,总结了近期研究进展,围绕肿瘤和T淋巴细胞相互关系,从T细胞对肿瘤识别和耐受、肿瘤下调识别分子导致活化T细胞丧失识别能力、肿瘤抵抗凋亡助其逃逸免疫、肿瘤通过抑制性受体和分子诱导T细胞无能耐受和凋亡、肿瘤细胞攻击T细胞逃避免疫、和肿瘤依赖Treg和MDSC抑制免疫等方面总结了理解思路,对肿瘤免疫消除(elimination)、免疫相持(equilibrium)和免疫逃逸(escape)三个阶段对抗T细胞免疫监视的机理提供参考,对肿瘤治疗具有重要意义。
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  单克隆抗体仿制药物的结构分析策略

  贾伟, 陈熙, 周春喜, 宋兰坤

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 93-98.

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  市场高达数千亿美元的单克隆抗体药物即将结束专利保护期,这对发展中国家产业升级,提高国民医疗水平,都是一次难得的战略机遇。然而,单抗类蛋白仿制药的研发与质控工作难度巨大,必须使用液相色谱-质谱联用技术进行分析。针对单抗仿制药结构必须进行的分析项目(氨基酸序列表达正确性、糖基化修饰形态相似性、以及高级结构统一致性)的液质分析方法进行了系统介绍。此外还就分析工作效率及质控过程的法规依从问题予以讨论。
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  甜菜胞囊线虫抗性基因及遗传工程改良策略

  章洁琼, 蔡大广, 唐桂香

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 99-105.

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  甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)是甜菜的重要病害之一,给甜菜生产造成了极大的损失。随着分子生物学和遗传工程技术的发展,采用遗传工程改良策略进行甜菜抗性品种选育是甜菜胞囊线虫防治中最经济、有效的方法。介绍了甜菜胞囊线虫的生育史及抗性机制,综述了甜菜胞囊线虫抗性基因的克隆和鉴定研究进展及甜菜胞囊线虫抗性育种的遗传工程改良策略,并提出今后甜菜胞囊线虫抗性育种的展望。
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  转基因动物及其产品的安全评估方法研究进展

  余乾, 赵二虎, 曹礼静, 赵谦, 赵永聚

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 106-111.

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  目前,转基因动物技术发展迅速并广泛应用于食品、医药、农业和生物材料等众多领域,带来了巨大的经济效益和社会效益,且发展潜力巨大。同时,转基因动物及其产品的安全性问题也日益突出,表现在转基因动物本身及产品安全性和环境安全性两个主要方面。"实质等同性原则"是国际上转基因动物安全性评价的基本原则。从转基因动物及其产品作为食品、药品等的安全性评估;从转基因动物对生态环境安全和影响的评估和非预期效应的评估等三个方面进行了阐述,并对我国转基因动物评价体系的构建提出建议。
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  植物Shaker K⁺通道的研究进展

  库文珍, 赵运林, 董萌

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 112-118.

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  钾离子通道是植物钾离子吸收的重要途径之一。Shaker K⁺家族通道是K⁺通道中最早发现、且研究最深入的K⁺通道家族。近年来,已从多种植物或同种植物的不同组织器官中分离得到多个Shaker K⁺钾离子通道基因,如AKT1,AtKC1,QsAKT1,GORK,AKT2等。从结构、表达部位、生理功能和调控等方面介绍了植物Shaker K⁺通道的研究进展。
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  生物法合成丙烯酸的研究进展

  孟青青, 杨建国, 王凤寰

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 119-127.

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  丙烯酸是一种重要的化工原料, 被广泛应用于涂料、超吸附材料等领域。目前丙烯酸的获得主要通过丙烯氧化,但由于石油资源日渐枯竭以及生产过程造成的环境问题,利用生物质资源生产丙烯酸已成为研究热点。介绍了丙烯酸的性质及其在工业上的应用,并详细综述了生物法制备丙烯酸的研究进展。根据丙烯酸生产中是否应用传统的化工过程,将其分为半生物合成和全生物合成。半生物法主要包括乳酸化学法脱水以及丙烯腈、丙烯酰胺的生物转化;全生物法主要包括乳酸生物法脱水、3-羟基丙酸途径、糖直接发酵法以及DMSP(二甲基巯基丙酸内盐)途径。由于乳酸发酵的工艺成熟、原料易得,因此对乳酸脱水进行了重点介绍,其中生物法脱水符合可持续发展的要求,对其进行了详细介绍。同时还分析了各种方法的优缺点,探讨了利用生物质资源生产丙烯酸的研究趋势。
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  毛干DNA提取方法概述

  管政, 陈爱亮

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 128-134.

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  毛干作为最容易取得的一种无创、运输和储存方便的生物样本,对从核酸分子水平上进行各方面研究有着十分重要的意义。但毛干中DNA含量低,不易提取,而且存在大量角蛋白和色素,纯化不净会对下游PCR扩增等反应产生抑制作用。基于毛干DNA提取现状,综述并比较了近三十年动物及人类毛发的毛干DNA提取、纯化等相关方法,拟为毛干DNA提取在分子生物学各领域的推广应用提供充分的文献支持和参考。
专题
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  “十一五”863计划“纳米生物材料研发”重点项目课题布局及实施情况分析

  王德平

  中国生物工程杂志. 2012, 32(10): 135-138.

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  简要分析了"十一五"期间国家高技术研究发展计划(863计划)"纳米生物材料研发"重点项目的课题设置及实施情况。分别从本重点项目研究方向及课题设置、课题承担单位及研究人员结构、课题完成情况及所取得的代表性研究成果等方面进行了具体分析和归纳总结,供广大科技工作者参考。