目的:研究曲古抑菌素A (Trichostatin A, TSA)下调γ干扰素(interferon-gamma, IFN-γ)诱导的人肝癌细胞HepG2内吲哚胺2, 3-双加氧酶(indoleamine 2, 3-dioxygenase, IDO)表达的分子机制。方法: Western blot 检测TSA在IFN-γ诱导的HepG2细胞中IDO的表达、信号转导及转录激活子1(STAT1)的磷酸化和干扰素调节因子1(IRF-1)的诱导表达情况。用免疫细胞化学法检测TSA处理HepG2细胞后对IDO表达的影响。流式细胞术分析TSA处理后IFN-γ受体2表达量的变化,进一步在激光共聚焦显微镜下观察TSA对STAT1核转位的影响,利用双荧光素酶报告基因系统检测TSA对IFN-γ激活位点(γ-activated sites, GAS)、干扰素刺激应答元件(interferon stimulated response elements, ISRE)和核因子-κB (NF-κB)的激活的影响。结果:TSA以剂量依赖方式下调HepG2细胞内IFN-γ诱导的IDO表达、能明显抑制STAT1第701位酪氨酸的磷酸化和STAT1的核转位,但是上调IFN-γ受体2受体的表达。双荧光素酶报告基因分析和Western blot结果表明:TSA能显著抑制GAS和IRF-1 的激活却不能抑制NF-κB和ISRE的激活。 结论:TSA能下调IFN-γ诱导的HepG2细胞中IDO的表达,其机制可能是与其抑制STAT1的磷酸化和核转位,以及抑制STAT1与GAS的结合有关,而不是通过下调IFN-γ受体的表达来实现的。
通过在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中过表达热休克蛋白70以提高其表达抗体的能力。首先从中国仓鼠基因组DNA中扩取HSP70基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1-HSP70,再将重组质粒稳定转染到CHO/dhfr-细胞中,筛选获得稳定的细胞系,运用RT-qPCR检测和Western blot分析HSP70基因的过表达。在过表达HSP70的CHO细胞组和对照细胞组(转染空载体pcDNA3.1的CHO细胞组)中分别转染表达抗-HBs的质粒,应用ELISA检测两组细胞表达抗-HBs的能力。RT-qPCR结果显示实验组CHO细胞中HSP70基因的表达量明显高于对照组细胞;ELISA检测结果表明过表达HSP70的CHO细胞组抗-HBs表达量高于对照组细胞(P<0.05)。研究揭示HSP70能有效促进细胞内分泌性蛋白的表达。
目的: 构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,并对其功能进行验证。方法: 设计一个包含人巨细胞病毒启动子(CMV promoter)、T7启动子、信号肽基因、血凝素A表位基因(HA)、多克隆位点区域(MCS)、c-myc抗原表位、血小板来源的生长因子受体跨膜区域(PDGFR TM)及牛生长激素多腺苷酸化信号(BGH polyA)等八种元素的表达盒Ⅱ(Expressing cassette Ⅱ),在其上下游添加Nru Ⅰ酶切位点后,进行人工化学合成,连接到克隆载体pGH中得pGH-Ⅱ;用Nru Ⅰ酶切pGH-Ⅱ,回收1 300bp左右的片段,去磷后插入到pVAX1的相应位点,Nru Ⅰ及Bgl Ⅱ/Pst Ⅰ酶切鉴定,获得新型基因疫苗真核表达载体pVAX2;然后以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,将其分别构建至两个不同的表达盒内,脂质体转染BHK-21细胞,利用RT-PCR及荧光显微镜技术进行该载体的功能验证。结果: 两个表达盒内的EGFP基因在BHK-21细胞均能高效表达,相互间不受影响,且新构建的表达盒具有蛋白展示功能。结论: 成功构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,为多价DNA疫苗的研究奠定了坚实基础。
目的:构建携带人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因的慢病毒表达载体及探索高滴度第三代慢病毒包装体系的建立,并观察hTERT基因在细胞中的表达调控。方法:将hTERT基因片段插入慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒表达质粒pCDH-hTERT。通过酶切、DNA测序验证 hTERT片段的准确性后,将pCDH-hTERT、pCDH-PACK-GAG、pCDH-PACK-REV和 VSV-G共转染包装细胞293T,浓缩上清并测定病毒滴度获得重组慢病毒,并通过PCR及293T中hTERT蛋白的表达鉴定重组慢病毒。将重组慢病毒感染靶细胞,通过检测标记蛋白-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、hTERT蛋白表达和端粒酶活性进一步验证pCDH-hTERT在细胞中表达。结果: pCDH-hTERT携带正确hTERT基因,将其与包装质粒共转染293T细胞能产生重组病毒;病毒基因组PCR证实hTERT基因插入,感染293T后可检测到hTERT蛋白的表达;目的基因hTERT能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞并稳定表达,荧光显微镜下可直接观察GFP;RT-PCR、Western blot及TRAP-PCR-ELISA 法检测感染后的细胞,发现hTERT mRNA、hTERT蛋白的表达及端粒酶活性明显增强。 结论:成功构建了第三代慢病毒表达载体pCDH-hTERT,并获得高效的重组慢病毒,能将外源hTERT基因导入靶细胞重建端粒酶活性, 为构建永生化细胞系奠定基础。
目的:比较两种miR-122转基因小鼠过表达载体构建方法,为建立miR-122过表达转基因小鼠奠定基础。方法:PCR扩增长约291bp的pre-miR-122的序列,分别定向克隆到pBROAD3-GFP载体GFP基因上游内含子或下游3'UTR区域,两种质粒分别转染293T细胞,Q-PCR检测miR-122和GFP的表达水平,并观察GFP绿色荧光。miR-122 sensor reporter是将3个miR-122成熟序列的反义序列串联克隆至psiCHECK2载体luciferase 3'UTR中,然后分别与2种miR-122过表达质粒载体共转染293T细胞,最后检测荧光素酶活性来鉴定miR-122调控功能。结果:2种构建方法的miR-122表达水平都明显增高,而只有插入到GFP基因3'UTR的质粒表达GFP功能正常。结论:构建microRNA过表达载体时,microRNA位于报告基因3'UTR区域不会影响microRNA和报告基因的功能;构建的两种miR-122过表达质粒载体都可应用到转基因小鼠研究中,而将miR-122插入到GFP下游的方法则更利于miR-122的表达。
Nanog基因是在早期胚胎和干细胞等多能性细胞中特异表达的重要基因,但有关猪Nanog基因功能的相关研究甚少。四环素诱导干扰载体是一种可通过四环素等药物条件性诱导干扰目的基因的载体,尤其适用于在发育过程中起着关键作用的基因沉默。常规的四环素干扰系统为二元载体,与一元载体相比获得针对特定基因干扰的稳定细胞系所需周期更长。首先通过构建pGenesil 1.0-shRNA重组干扰载体,瞬时转染稳定过表达猪Nanog基因的猪胎儿成纤维细胞后通过Realtime-PCR筛选出干扰效率可达80%以上的干扰片段。之后将筛选得到的干扰片段插入到改造的一元四环素诱导干扰载体TREsilencer,对稳定表达猪Nanog基因的猪胎儿成纤维细胞进行了瞬时转染。实验分别通过光密度检测以及Realtime-PCR检测了不同浓度doxycycline的诱导效率和干扰效率。结果表明,所构建的四环素诱导干扰载体TREsilencer-shRNA5随着四环素浓度的增加,诱导Nanog基因的干扰效率增加,在处理浓度为1μg/ml时干扰效率可达70%以上,为后续得到可诱导的稳定干扰猪Nanog基因的细胞系和进一步研究猪Nanog基因功能奠定了基础。
血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是抑制肿瘤生长和转移的重要靶点。为获得抗VEGF单抗细胞株,构建了rhVEGF165工程菌,并利用复合自动诱导获得高效表达。经纯化获得高纯度rhVEGF165蛋白,经检测具有促人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)增殖活性,其EC50为2.4ng/ml。免疫小鼠,获得了3株能稳定分泌抗VEGF单抗的杂交瘤细胞株,为开发VEGF治疗性单抗提供了重要基础。
KLF4是Kruppel样转录因子(kruppel-like factors, KLF)家族中的一员,是维持胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)全能性的重要转录因子。蛋白质转导结构域(protein transd uction domain, PTD)能够携带大分子进入细胞。为了获得具有穿膜功能的重组KLF4蛋白,利用原核表达载体PKYB表达KLF4与PTD的融合蛋白PTD-KLF4,用Ni柱纯化融合蛋白并作Western blotting鉴定。利用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记PTD-KLF4检测其穿越中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO)细胞细胞膜的能力;用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)检测重组融合蛋白PTD-KLF4结合目的DNA的活性。结果表明:重组PTD-KLF4可以成功进入细胞、定位细胞核内,穿膜效率为(22.29±2.1)%。重组融合蛋白PTD-KLF4引起细胞形态变化,并具有与目标DNA序列特异结合的能力。重组PTD-KLF4的制备为外源蛋白诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, IPSCs)奠定基础。
在TB培养基的基础上,通过单因素分析和正交设计对重组大肠杆菌产角质酶-CBM发酵进行优化,得到最适培养基的组分为:甘油5 g/L,蛋白胨 16 g/L,MgSO4·7H2O 2.5 mmol/L,K2HPO4 13.7 g/L,KH2PO4 1.53 g/L,菌体生长至对数前中期时添加终浓度为1 g/L乳糖 和0.75 g/L 甘氨酸,30℃发酵48 h,角质酶-CBM产量可达63 U/ml,较TB培养(20 U/ml)提高了近3倍。考察了热激作用、渗透调节物质及温度两控制对角质酶-CBM分泌表达的影响,在添加Lactose和Glycine后,发现在添加终浓度为75 mmol/L的L-脯氨酸,37℃热激1 h或47℃热激0.5 h,变温至25℃发酵,角质酶-CBM产量可达90 U/ml,较TB恒温培养提高了近四倍。
利用筛选到的Aspergillus niger P1和Bacillus subtilis H1混菌发酵改良棉粕蛋白,以提高其利用率。结果表明,混菌发酵的最佳发酵条件为:棉粕 40 g,硫酸铵0.2%,麸皮15%,含水量50%,接种量 15%,同时接菌且两菌接菌比例(A.niger P1 ∶ B.subtilis H1)为2 ∶ 1,发酵温度30 ℃,pH约为6.0,发酵时间 60 h。在此条件下发酵后棉粕小肽含量可提高至18.36%,平均肽链长度可降至4.23,体外消化率可提高至88.59%,显著提高了改良棉粕蛋白的效果。在相同发酵条件下比较单、混菌发酵过程的各营养指标发现:A.niger P1可分泌丰富的酸性蛋白酶,B.subtilis H1可分泌丰富的中、碱性蛋白酶,混菌发酵各种蛋白酶的活性显著提高。混菌发酵将大多数大于10个氨基酸组成的多肽降解为1~3个氨基酸组成的小肽,降解效果明显优于单菌发酵。两菌株具有很好的"协同性",可充分利用棉粕基质,协同改良棉粕蛋白。
以枯草芽孢杆菌D17和Bs16(1 ∶ 1)共发酵物为主药,通过配方设计、制剂稳定性、抗紫外能力及其室内外抑菌生物活性实验,进行其高效生防乳剂优选。结果表明乳剂1和乳剂9最佳:其室内拮抗生物活性最强,小区试验中对灰霉菌的防效也可达85%以上,与常用的化学农药防效相当;持效期延长至15天以上,与常用化学农药有显著性差异;抗紫外能力强,经过180 min的紫外照射制剂单位体积的有效活菌量仍可达109cfu/ml以上;储藏稳定性好,常温密封避阴条件下保质期可达1年以上,是具有较高商品开发价值的绿色环保型生物农药制剂。
随着诊断及治疗领域内单克隆抗体及片段的广泛应用,传统的杂交瘤生产技术已很难满足对其日益增长的需求。由于基因重组技术及生物工程技术的迅速发展及日益成熟,大规模生产单克隆抗体/片段已成为可能。对目前常用的载体及表达系统进行列举和比对,这些系统包括大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统。在第二部分,对提高表达产率的策略进行了探讨,其中包括:表达蛋白质本身的修饰(如蛋白融合、定点突变)、表达系统的选择、密码子优化、表达环境的优化和抗体体内表达等。最后,对抗体/抗体片段高表达的前景作了展望,认为生物信息学将在此领域发挥重大作用,并且相信建立高表达平台的时机已经来到。
采用易错聚合酶链反应和DNA改组技术构建野生型梅花鹿过氧化氢酶(CAT)基因的突变体文库,并随机对两种方法所得产物各5个样品做序列测定。序列分析结果表明突变率分别为0.329%和27.58%,易错聚合酶链反应体系的错配率可以比普通PCR体系提高约10倍,DNA改组的突变率则更高,但是难以避免由于突变率太高造成的目的基因无法正确翻译这一情况。另外,应用邻接法(neighbor-joining, NJ)对随机选择的过氧化氢酶基因突变体序列和野生型序列做核酸和蛋白质序列的NJ进化树,进化关系与突变率分析基本一致。
纳米技术的兴起,对生物医学领域的变革产生了深远的影响。纳米材料是纳米技术发展的重要基础,它具有许多传统材料所不具备的独特的理化性质,因此在生物医学、传感器等重要技术领域有着广泛的应用前景。对几类常见的纳米材料包括纳米金、量子点、磁性纳米粒子、碳纳米管和硅纳米线在蛋白质、DNA、金属离子以及生物相关分子检测方面的应用进行综述。
β-catenin(β-连环素)是一种由位于染色体3p21—22的CTNNB1基因编码的具有介导细胞间黏附及信号转导等多重功能的重要分子,其通过与多种蛋白质结合调控细胞的增殖和分化,在胚胎发育和肿瘤发生中发挥关键作用。近年来,越来越多的研究证实经典Wnt通路的异常激活在肝癌中具有重要作用,而作为Wnt信号转导通路中枢纽分子的β-catenin的异常表达与肝癌的发生、发展密切相关。就近几年β-catenin分子生物学功能及其在肝癌研究中的进展进行简要综述,为进一步阐明β-catenin在肝癌中的作用机理及以β-catenin为靶点的临床治疗提供理论依据。
类风湿关节炎(RA)是一种病因和发病机制尚不清楚的自身免疫疾病,一般认为是由多种遗传因素和环境因素共同作用的结果。遗传因素中以组织相容性白细胞抗原HLA最为重要,另外作为非HLA的肽基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)也参与了RA的发病。PADI4是一种翻译后修饰酶,可在钙离子存在的情况下将精氨酸残基转化为瓜氨酸残基,瓜氨酸化后的蛋白质往往改变其分子构象,从而导致其生化活性亦发生改变。在不用种族的人群中,PADI4基因多态性与RA的易感性不尽相同。PADI4在RA患者血清中含量明显升高,在机体内产生自身抗PADI4抗体,并且PADI4瓜氨酸化多种蛋白质引起机体自身的免疫反应参与RA的发生与发展。近些年来的其他研究表明PAID4也参与了肿瘤、溃疡性结肠炎、多发性硬化症的发病。尽管针对PADI4的研究已经取得了很多重大进展,但是仍然存在很多悬而未决的问题等待科研工作者进一步的研究和证实。
由于海洋环境和微藻本身的特殊性,从微藻中筛选抗菌物质已成为当今研究的热点之一,并且具有广阔的应用前景。对近年来从微藻中筛选抗菌物质的研究现状和进展进行了综述,重点总结了抗菌活性物质筛选过程中的模型选用,并介绍了新筛选模型的发展,指出了难点问题及可行的解决方法。
腈水合酶催化反应在有机合成领域已有广泛的应用。作为一类重要的催化剂,腈水合酶可以将腈类物质转化为相应的酰胺。由于这种酶具有固有的立体和区域选择性,在精细化工领域已成为绿色、温和、对同分异构体具有选择性的催化剂。同时腈水合酶在生物修复和环境保护中也起着重要作用。综述了目前国内外腈水合酶的研究进展,包括降解腈类的微生物多样性、腈水合酶的催化特性、产腈水合酶菌株的改造以及腈水合酶相关基因的克隆与研究。对固定化酶和腈水合酶的应用也进行了叙述。
温室效应、水资源短缺和能源危机是21世纪人类面临的三大挑战。微藻是一种水生植物,在CO2减排、废水生态修复及生物能源领域已成为全球研究热点。综述了微藻在CO2生物捕集和废水生态修复的应用研究进展。微藻生物柴油现已成为全球研发热点,但研究主要集中在某个单元的最优化设计,而对各单元之间相互作用和耦合的重要性缺乏充分认知,提出了将CO2生物捕集、废水生态修复、生物柴油制备、藻渣替代水煤浆与煤共气化的理念,这对微藻生物过程的高效全局优化和环境综合治理具有重要意义,是未来我国发展低碳经济的有效途径,并在此基础上对微藻产业规模化的未来核心研究方向进行了展望。
干细胞由于其巨大的研究和应用潜力而成为全球关注焦点。许多国家的政府、研究机构和企业对其加大投入,并取得了巨大的进展。与干细胞相关的论文和专利数量在2001年后均快速增加,其临床和临床前研究的数量也越来越多,但目前仍以脐血干细胞项目为主。美国在干细胞研究领域的各个方面均处于世界顶级地位。中国与干细胞相关的论文和专利数量也居世界前十位,但没有一家机构居世界先进行列,也缺乏新产品研发。面对美国相关政策的放宽所带来的格局变化,中国应该积极应对。
以波特的钻石模型为基础,根据生物医药产业的特点形成了六因素钻石模型的分析框架。以石家庄为例,对影响产业竞争力的生产要素、需求要素、相关和支持性产业要素、企业战略结构和竞争要素、政府、创新这六个要素进行了分析。并对提升产业竞争力的路径进行了阐释,通过发挥比较优势,因地制宜选择合适的产业集群发展模式,积极推进"政产学研医"结合,多种手段搞好创新,积极承接生物制药产业外包服务,加强中介、信息等产业支撑建设,搞好社会文化对生物医药产业的支撑等,保证石家庄生物医药产业的可持续发展。
