目的:建立miR-106b转基因小鼠模型,探讨其在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)发病中的作用。方法:构建miR-106b表达载体,显微注射法建立miR-106b转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,real time RT-PCR检测miR-106b转基因小鼠脑组织中miR-106b的表达情况,Western blot检测miR-106b转基因小鼠脑组织中TGFBR2蛋白的表达。结果:构建了高表达miR-106b转基因小鼠;与对照相比,miR-106b转基因小鼠脑组织中TGFBR2蛋白的表达升高。结论:miR-106b转基因小鼠的建立为研究该microRNA在AD发病中的作用提供了工具。
将两种人干细胞因子(hSCF)模拟肽(CS2和LS2)分别与 c-jun亮氨酸拉链在大肠杆菌中融合表达,比较模拟肽与融合蛋白的生物学活性。通过搭桥PCR的方法,构建分别含有CS2和LS2与c-jun亮氨酸拉链融合蛋白及单独c-jun亮氨酸拉链编码序列的三种原核表达质粒pET30a-CSJ, pET30a-LSJ和pET30a-Jun,在E.coli BL21中进行表达,经镍柱和Sephadex G-50 柱 纯化后,SDS-PAGE和质谱法检测重组融合蛋白(CSJ,LSJ)和c-Jun的理化性质,MTT法检测融合蛋白刺激UT-7细胞增殖的活性。结果显示CSJ,LSJ和c-jun在E.coli中均呈20%左右表达,经纯化后其纯度达95%以上,分子量分别为7336.08,7991.54和6672.74。细胞学活性实验显示:与CS2和LS2相比,CSJ和LSJ促进UT-7细胞增殖的活性提高约1000倍。在大肠杆菌中成功表达了hSCF模拟肽与c-jun亮氨酸拉链融合蛋白, 融合蛋白活性显著高于合成的hSCF模拟肽。
目的:构建IRES及polyA-promoter介导人血管生成素-1(Angiogenin-1,Ang-1)和人血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor165,VEGF165)双基因共表达的腺病毒载体,比较IRES与polyA-promoter不同表达模式及其对位于二者前后基因的表达效率和诱导兔角膜新生血管的形成功能,为今后构建双基因或多基因高效共表达载体提供实验依据。方法:以pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165质粒为模板,PCR扩增人VEGF165及Ang-1基因片段,分别将其亚克隆至改建的 pAdTrack-CMV-PolyA-promoter及pAdTrack-CMV-IRES转移质粒中,构建pTrack-CMV-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165、pTrack-CMV- VEGF165-polyA-promoter-Ang-1、pTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1基因重组转移质粒,再与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中同源重组,然后经PacI线性化后转染QBI-293A人胚肾成纤维细胞(简称293A细胞),收获腺病毒重组病毒子Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165及Ad-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1,Ad-VEGF165-IRES-Ang-1,RT-PCR检测Ang-1和VEGF165在QBI-293A细胞中的转录,ELISA法分别检测不同腺病毒载体目的基因的表达量,比较分析Ang-1与VEGF165基因在IRES和polyA-promoter介导的不同腺病毒表达载体中的表达能力,及在同一腺病毒表达载体中前后不同位置的表达效率。并进一步于兔角膜缘注射Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165,Ad-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1,Ad-VEGF165-IRES-Ang-1,Ad-Ang-1-IRES-VEGF165,检测角膜新生血管的面积,并比较其诱导血管形成能力的差异。结果:测序显示Ang-1和VEGF165序列正确,不同重组腺病毒载体均获得成功包装,病毒效价可达2~5×1010pfu/ml,RT-PCR检测Ang-1和VEGF165均能有效转录,ELISA法检测结果表明Ang-1、VEGF165基因不仅均能在细胞中有效表达,而且IRES介导的Ang-1及VEGF165基因,无论在IRES上游或下游,其表达量均低于polyA-promoter相同位置的Ang-1及VEGF165基因表达量,大约降低60%~70%左右,同时Ang-1/VEGF165在同一载体上、下游不同位置,其下游基因的表达量均明显低于上游基因表达量,大约降低30%~40%左右。角膜血管形成动物实验的结果表明Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1及Ad-VEGF165-IRES-Ang-1诱导角膜新生血管形成面积和血管密度的能力相对较强,且前者比后者效果更为显著。结论:在腺病毒表达载体中,由IRES/polyA-promoter介导的Ang-1与VEGF165双基因均能在细胞中成功表达,并具血管诱导性,但polyA-promoter比IRES介导的双基因表达效率高,诱导血管形成能力强;同时两者下游基因的表达量及血管诱导性能均明显低于上游基因。
目的:构建结核分枝杆菌eis基因的穿梭表达载体,鉴定其在重组耻垢分枝杆菌中的生物活性。方法:采用PCR技术克隆结核分枝杆菌eis基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV-eis,经酶切和测序鉴定其正确性,用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc2155中,采用SDS-PAGE和Western blot检测eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达。结果:成功构建结核杆菌eis基因穿梭表达载体pMV-eis;生长曲线说明重组质粒不会影响耻垢分枝杆菌的体外生长;SDS-PAGE 和Western blot检测证实eis在耻垢分枝杆菌中可表达出相对分子量约42kDa的Eis蛋白。结论:成功构建了eis基因穿梭表达质粒pMV-eis,且该重组质粒在耻垢分枝杆菌中具有生物活性,为下一步研究表达产物Eis的功能奠定了一定基础。
硫胺素单磷酸激酶(ThiL)在ATP存在下催化硫胺素单磷酸(TMP)形成硫胺素焦磷酸(TPP)和ADP,硫胺素焦磷酸就是维生素B1的活性形式。硫胺素单磷酸激酶属于一个小的ATP结合蛋白超家族成员。将来源于福氏志贺痢疾杆菌2a(301株)ThiL基因构建入pET-22b(+)表达载体,在大肠杆菌中得到高效表达,经过两步纯化,得到高纯度蛋白,用于晶体生长,经过对其晶体生长条件进行摸索和优化,得到了能用于X-射线衍射的单晶,为其结构解析、催化机理研究和药物设计提供了基础。
姜黄药用的主要有效成分是姜黄素,曾被认为是理想的抗癌化学治疗药物之一,然而,姜黄素在水中的溶解度低,体内吸收少,生物利用度低,极大地限制了它的应用。采用乳化聚合的方法,成功地制备了粒径在250nm左右的表面带正电荷的聚氰基丙烯酸正丁酯包载的姜黄素纳米粒,该纳米姜黄素仍然保留了姜黄素本身的生物活性,可抑制人肝癌细胞株HepG2细胞的生长,阻滞细胞周期于G2/M期,对HepG2细胞有抗增殖作用,能诱导细胞凋亡,下调在肿瘤血管生长中起重要作用的血管内皮生长因子和调控血管内皮生长因子的环氧合酶-2的表达。
在北京,本世纪初出现了一种外来入侵植物——刺萼龙葵。这种植物起源于北美洲,全植株有毒,含有茄碱(一种神经毒素);另一方面,茄碱又有抑瘤等功效。为了在熟悉刺萼龙葵的毒害程度、治理这种外来入侵植物的同时,能够废物利用,从中有效获得茄碱等有药理或经济价值的成分,通过检测全植株提取物对肿瘤细胞(H22)膜ATPase活力的抑制效应,并对照茄碱、传统化疗药物环磷酰胺的功效,对北京外来入侵植物刺萼龙葵抑瘤效应进行了评估。结果发现,北京自然界已入侵生长的刺萼龙葵的细胞毒性约相当于3.63 mg/g茄碱的当量,大约相当于(或略高于)马铃薯嫩芽的茄碱当量。因此,实行废物利用,从入侵生长的刺萼龙葵中获得茄碱(等药用成分)大有作为,可以在治理生态中获得经济效益,并解放出马铃薯等具有其他重要经济价值作物的生产力。
通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶基因,将基因片段克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ103中,转化枯草杆菌WB600得基因工程菌进行外源表达。在1.5%的麦芽糖初始发酵培养基上摇瓶培养,48 h后重组枯草杆菌产酶活性为6.1U/ml。通过单因素分析和响应面分析对重组枯草杆菌产CGT酶摇瓶发酵条件进行优化。分析得到培养基关键组分麦芽糖,玉米淀粉和酵母粉三者最佳浓度分别为:15.5g/L,13g/L和20g/L。在此条件下,摇瓶培养36h后α-CGT酶活性为17.6U/ml,5L罐分批发酵30h后酶活达到20U/ml (水解活性为1.4×104 IU/ml)。
研究了T4溶菌酶的中试发酵放大生产。在200L发酵罐中毕赤酵母诱导表达T4溶菌酶蛋白,发酵液蛋白表达量达到1.69g/L,酶活达到192U/mg;制得冻干酶粉211.1g。经测定粗酶粉中T4溶菌酶的含量达到68.9%,酶活为182U/mg,总收率达到66%,成功建立了一条T4溶菌酶的中试发酵生产工艺线路。
利用PCR技术从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出其编码嘌呤核苷磷酸化酶的两种基因deoD和punA,构建工程菌并采用金属螯合层析纯化PNP702和PNP816,酶学性质研究表明:二者具有一致的最适反应温度(60℃)和最适反应pH值(7~8),PNP816磷酸解肌苷的催化效率(kcat/Km)比PNP702高出11.12倍。底物特异性试验表明:PNP702为高分子量的六聚体,而PNP816为低分子量的三聚体。分别以纯化酶和工程菌菌体为酶源,以肌苷或鸟苷为核糖基供体,TCA(1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺)为底物,酶法合成核苷类抗病毒药物利巴韦林,PNP816和工程菌XL-Blue(pPNP816)较PNP702和工程菌XL-Blue(pPNP702)具有更高的催化速度和底物转化率,表明来源于微生物的低分子量的三聚体PNP在核苷类药物和中间体微生物酶法合成中具有更高的应用价值。
介绍一种构建高效低背景T载体的通用方法。使用含有ccdB致死基因的gateway cassette 片段作为插入DNA片段以降低背景干扰,连接到pGEM-T easy 载体骨架上,通过内切酶XcmI酶切重组质粒即得到T 载体。对重组质粒进行了酶切,PCR 和测序验证,并且利用连接效率实验证实了T 载体具有100% 的阳性克隆率。构建的T载体不仅继承了pGEM-T easy的众多优点,而且具有高效、低背景的卓越特点;另外,引入的常用限制性内切酶和 LR重组反应介导的gateway 技术为亚克隆提供了便利。
阿维链霉菌在复合培养基中生长时合成大量蛋白酶以满足菌体分解有机氮源进行生长代谢的需要。而大量蛋白酶的存在对二维电泳的蛋白质组分析细胞蛋白质样品的提取带来了很大的困难。根据阿维链霉菌胞内蛋白酶的组成,以EDTA、PMSF、Bestatin、Pepstatin和E-64等5种蛋白酶抑制剂为基础,通过单因子实验和正交实验优化得到了高效的蛋白酶抑制剂复合配方。验证实验表明,该复合蛋白酶抑制剂在阿维链霉菌细胞蛋白质样品提取中,具有良好的蛋白酶活性抑制效果。
目的:利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、敏感、特异的检测产气荚膜梭菌的方法,及时用于指导临床治疗。方法:以产气荚膜梭菌16srRNA基因作为靶序列,设计一对特异引物和探针,以伤口分泌物和脓液提取的核酸作为模板,利用已经优化的引物和探针进行PCR反应;同时与细菌培养作比较,验证此方法的快速性、敏感性及特异性。结果:建立的反应体系在上游引物浓度为0.45μmol/L,下游引物浓度为0.15μmol/L,探针浓度为0.3μmol/L时,具有很好的敏感性,与21种其他细菌均无交叉反应,其敏感性为9cfu/反应体系。荧光定量PCR检测结果与细菌培养结果完全一致。结论:所建立的荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,能对产气荚膜梭菌感染做出准确的检测报告,具有对战时高发疾病气性坏疽进行快速和定量检测潜质。
目的:根据外膜蛋白 FopA 的序列信息,建立土拉弗朗西斯菌 FopA蛋白全长(FopA-L)和部分(FopA-S)的特异性抗原的 BL21 表达系统,获得高活性的重组 FopA-L、FopA-S蛋白并制备相应的多克隆抗体,为土拉菌的监测、诊断和治疗提供依据。方法:通过 pET100 质粒构建FopA-L及FopA-S的表达载体,转化大肠杆菌BL21细胞并诱导表达FopA-L及FopA-S蛋白,螯合镍离子次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲合层析纯化FopA蛋白,用重组蛋白免疫大耳白兔制备多克隆抗体,通过 ELISA、Western 印迹、胶体金免疫层析技术等方法进行检测。结果:构建了FopA-L及FopA-S的表达载体,获得相应的高表达目的蛋白 BL21 细胞株,用表达的蛋白为抗原成功制备了 FopA特异性的抗体,效价皆在1 ∶100000以上且特异性良好。结论:FopA-S与FopA-L两种抗原和相应抗体的制备为建立土拉菌快速检测方法奠定了基础。
尝试将一种基于图的Fiedler向量的聚类算法引入到基因表达谱数据的肿瘤分类中来。该方法将分属不同类的所有样本通过高斯权构造Laplace完全图,经SVD分解后获得Fiedler向量,利用各样本所对应的Fiedler向量分量的符号差异来进行基因表达谱数据的分类。通过模拟数据仿真实验和对白血病两个亚型(ALL与AML)及结肠癌真实数据实验,证明了这一方法的有效性。
基于PCR的染色体步移技术主要用于分离已知序列侧翼的未知序列,为分离基因、步移调控区域及填补基因组测序的空隙提供极大便利。基于PCR的染色体步移技术依照原理可分成依赖连接介导PCR法和不需要酶切连接PCR法。综述了近年来以PCR为基础的染色体步移技术,比较了这些方法的原理及操作步骤,同时总结了依赖连接介导PCR法和不需要酶切连接PCR法的优点与缺点,以期对研究起到借鉴作用。
细胞打印技术是一种在体外构造具有生物活性的三维多细胞体系的先进技术。近年来,有关细胞打印技术的研究引起广泛的关注,其原因在于该领域具有明显的学科交叉与渗透融合的特点,它处于生命科学与快速成型技术、生物制造技术、生物科学和材料科学的交汇点。更加值得关注的是它为组织工程学突破二维研究的局限性,在三维尺度上精确控制与人体组织或器官相似的三维构造体方面的研究提供了一种新的思路。基于这一技术不仅在三维组织工程,还对细胞生物学、高通量药物筛选及细胞传感器等方面的前沿问题均有广阔的研究应用前景,介绍了近年来开发用于细胞打印的技术及其潜在的应用。
研制一种安全有效并能广泛使用的HIV疫苗对于预防和控制HIV的流行具有重要的意义。尽管人类在HIV-1病原学和免疫学方面的认识不断取得新的进步,对于HIV-1而言,普遍认为诱导保护性中和抗体的科学障碍很难逾越。在抗击HIV-1的感染中传统的疫苗策略不能提供保护。然而,近来的研究揭示在小部分HIV-1感染病人的血清中存在的某些抗体能够中和大多数的HIV-1毒株,对这些血清抗体的深入分析有助于人们揭示抗体识别的病毒表位,这些研究表明自然产生的能够中和HIV-1的中和抗体的发现可能引导未来疫苗设计的思路。高分辨率的结构信息将揭示Env 和中和抗体(Nab)结合区原子水平的结构,这些信息能够帮助设计更好的免疫原。
目前,多肽/蛋白质类药物多数需要采用注射剂型给药以确保其生物利用度。开发易于给药、病人顺应性高以及治疗费用更低的非注射剂型是非常有意义的。然而,多肽/蛋白质类药物直接进行非注射给药的生物利用度通常非常低,需要制备具有设计功能的载药系统,例如加入不同比例的酶抑制剂、吸收促进剂等以提高生物利用度。环糊精及其衍生物由于其能与客体分子形成包合物的特性,以及对粘膜的促渗透作用等,在多肽/蛋白质药物的非注射给药系统中获得了日益广泛的应用。综述了近年来环糊精及其衍生物在多肽/蛋白质类药物非注射给药体系中的应用情况。
噬菌体是自然界中广泛存在的细菌病毒,作为细菌的天然杀手,在细菌性感染尤其是多重耐药菌感染的治疗方面具有抗生素无法比拟的优势。综述了利用活噬菌体治疗细菌性感染的早期研究及近几年的初步临床试验结果、利用噬菌体裂解酶治疗细菌性感染的最新进展,指出了噬菌体治疗真正得以应用所面临的主要障碍并综述分析了一些具有一定可行性的解决方案,以期为噬菌体治疗的研究和应用提供参考,并推动噬菌体治疗研究的进一步发展。
从克雷伯氏菌胞外多糖的组成、功能及发酵工艺等方面概述了克雷伯氏菌发酵生产胞外多糖研究进展,并讨论了该发酵过程中存在的问题;同时指出,在现有基础上应用数学工具模拟优化发酵工艺并改良分离提取方法,并进一步对其进行开发应用是今后研究的重点。
