目的:通过外源注射不同剂量的重组人中期因子midkine(rhMK),研究其对大鼠膝关节软骨部分损伤的修复作用。方法:雄性SD大鼠双侧膝关节建立软骨部分损伤的动物模型,术后24小时分别向关节腔内注射生理盐水或rhMK (20μg/kg、60μg/kg、180μg/kg)。于术后8周将大鼠全部处死,取材进行组织学观察,从而确定最佳注射剂量;在药代动力学研究中,按最佳注射剂量向正常大鼠膝关节腔内注射rhMK,分别于注射后1小时、1天、3天、6天、9天、12天和15天处死大鼠,检测膝关节软骨组织中rhMK的含量。结果:不同剂量的重组蛋白对膝关节软骨部分损伤均有不同程度的修复作用,其中180μg/kg的剂量效果最佳;以180μg/kg的剂量向正常大鼠膝关节腔内注射rhMK后,经过Kinetica5.0药代动力学软件拟合后,计算得rhMK在软骨组织中的消除相半衰期为8.69天。结论:rhMK对大鼠膝关节软骨部分损伤有明显的修复作用,最佳注射剂量为180μg/kg,最佳注射时间间隔为8天。
核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)突变是近年发现的在急性髓系白血病中发挥重要作用的基因改变,为探讨NPM1突变对K562白血病细胞体外增殖和侵袭能力的影响,将载体pEGFPC1-NPM1-mA转染K562细胞系,构建稳定表达NPM1突变蛋白的白血病细胞株(K562-mA)。利用细胞生长曲线观察细胞体外增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期进程改变;细胞粘附、Transwell实验分别用以观察细胞体外粘附、迁移及侵袭能力。结果发现,NPM1突变转染后K562细胞体外增殖能力明显减弱;同时G1期细胞比例明显增高,S期细胞比例显著减低。与未处理组和空载体转染组细胞相比,K562-mA细胞体外迁移能力有所增加,但细胞粘附及侵袭能力却明显减弱。提示NPM1突变基因的表达能够抑制白血病细胞体外增殖和侵袭能力,为进一步深入探讨NPM1突变在白血病发生发展中的调控机制奠定了良好的基础。
为了研究膜联蛋白A2(ANXA2)基因表达水平与人肝癌细胞生物学行为之间的关系,采用已优化转染条件的磷酸钙法将针对ANXA2的siRNA重组质粒导入人肝癌细胞SMMC-7721并观察对靶基因表达及细胞生物学行为的影响。以半定量RT-PCR和Western blotting检测转染后不同时间(24 h、48 h、72 h和96 h)ANXA2 mRNA及蛋白表达变化;以MTT法、Hoechast33258染色及体外损伤修复实验等分析抑制ANXA2表达后对SMMC-7721细胞生物学行为的影响。结果显示:所设计的四条siRNA序列均不同程度抑制了ANXA2 的表达(p<0.05),且呈时间依赖性;细胞生长能力及运动能力被显著抑制(p<0.05),其抑制效应与ANXA2 表达敲低程度呈正相关。结论:ANXA2的高表达水平与肝癌细胞的凋亡、生长及运动能力密切相关,以RNAi方法抑制该基因的表达可以有效地抑制肝癌细胞的恶性生物学行为。上述结果为肝癌的实验性基因治疗研究提供了新的思路和对策。
核糖核酸酶抑制剂(Ribonuclease inhibitor, RI)是一种细胞内能够调节核糖核酸酶活性的胞浆蛋白,在分子生物学涉及RNA的实验中有广泛应用。商品化的小鼠RI(mRI)宣称其可能具有较高的氧化抗性。为获得mRI在大肠杆菌宿主中可溶性活性产物的有效重组表达,构建了含有mRI编码基因的重组质粒载体,在几种不同工程菌中进行了mRI蛋白的表达纯化,并观察了其氧化抗性特征。简单的组氨酸标签融合,即可在蛋白酶基因缺陷的BL21衍生的宿主菌中,经过适当诱导,获得较高水平活性产物的可溶性表达。纯化后产量在4~8mg/L水平,接近其他种属RI特殊优化表达系统的最高产量。该重组mRI与重组人RI(hRI)具有基本一致的核糖核酸酶抑制活性和抗氧化作用,与前人推测的抗氧化特征不同。
植物过氧化物还原蛋白BAS1是巯基依赖的过氧化物酶,通过催化的Cys残基还原过氧化氢,依赖NADPH的叶绿体硫氧还蛋白还原酶保持BAS1的还原态。玉米含有两种BAS1:2-Cys PrxA和2-Cys PrxB。利用RT-PCR方法从玉米幼叶中克隆了编码成熟2-Cys PrxA的基因,并将蛋白Cys34残基突变成Ser34。SDS-PAGE显示纯化的野生型和突变体蛋白为一条主带,分子量约为23kDa;体外蛋白结合实验表明纯化的叶绿体硫氧还蛋白还原酶通过分子间二硫键结合纯化的2Cys PrxA的C34S突变体,非还原SDS-PAGE显示纯化的野生型2Cys PrxA含有分子间二硫键组成的二体,而纯化的C34S突变体呈现单体,巯基专一性标记化合物AMS修饰及活性分析表明纯化的BAS1还原态是催化还原过氧化氢所所必须的,它由硫氧还蛋白还原酶及其辅酶NADPH所催化。
利用抑制缩减杂交文库从香蕉中分离获得一个cDNA片段,结合RACE技术获得该基因的全长序列,命名为MaBTB基因,该cDNA的ORF全长1 080个碱基。通过Blastx同源性分析结果显示该基因的氨基酸序列与水稻OsBTB、苜蓿MtBTB/POZ、拟南芥AtBPM4、葡萄VvBTB、玉米ZmBTB 、松树PsBTB基因的氨基酸序列同源性很高,分别为86%、85%、84%、84%、86%和87%。遗传进化树分析发现该基因与苜蓿MtBTB/POZ和拟南芥AtBPM4基因亲缘关系较近。用RT-PCR的方法研究该基因在不同胁迫处理下的表达特性,结果表明该基因在盐、乙烯和紫外线处理后其表达量逐渐增强;低温处理和香蕉尖孢镰刀菌4号生理小种处理后该基因表达量开始降低,随后逐渐升高;伤害处理后该基因的表达量没有明显变化。
黑曲霉纤维素酶三类不同酶系中,纤维二糖水解酶基因表达处于很低水平,导致纤维素酶总体活力水平不高。为构建黑曲霉纤维素酶高产菌株,采用基因工程方法,全基因合成拼接黑曲霉高表达葡萄糖淀粉酶基因glaA的强启动子片段与纤维二糖水解酶基因cbhB编码区片段,然后将杂合基因克隆到二元载体pCAMBIA1301上,重组质粒通过农杆菌介导转化黑曲霉分生孢子,携带杂合基因的T-DNA片段插入到黑曲霉转化子的染色体上,共筛选到48个具有潮霉素抗性的转化子。纤维素酶活力水平测定结果显示,转化子A3-9的CMC酶活力最高,为野生型黑曲霉菌株的1.31倍;转化子B1-7与A3-6的滤纸酶活力最高,为野生型黑曲霉菌株2.51倍。另外,初步分析了杂合基因在黑曲霉中的表达所需的诱导条件。
以氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)NH-10基因组DNA为模板,扩增得到D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因arDH,将其克隆到大肠杆菌表达载体JM109(DE3)中进行诱导表达。SDS-PAGE电泳分析ArDH的分子量约为30 kDa,是一个短链脱氢酶,既能催化D-阿拉伯糖醇氧化为D-木酮糖,又能催化D-木酮糖还原为D-阿拉伯糖醇。催化氧化反应时,对D-阿拉伯糖醇的Km为60.67 mmol/L,Vmax为0.803 U/mg;它能同时依赖于NAD+和NADP+,但是更加偏好辅酶NAD+;最适pH为12.0。还原反应对D-木酮糖的 Km为36.39 mmol/L,Vmax为1.71 U/mg;最优pH为7.0,最适温度均为30℃。
通过对莱茵衣藻849及其转基因衣藻lba进行光照强度、细胞浓度和培养基中硫酸盐含量三因素三水平的正交实验,确定了两个藻种的最佳产氢条件,同时对转基因藻和849产氢培养条件下的光合放氧速率和pH进行了检测。实验结果表明,在25 ℃下,莱茵衣藻849和转基因衣藻lba的最佳产氢条件都为光照强度 60μmol/(m2·s),细胞浓度为叶绿素含量12.5μg/ml,培养基中硫酸盐含量0μmol/L。莱茵衣藻849和转基因衣藻lba的最高氢气产量分别达到了349μl/mg chlorophyll 和634μl/mg chlorophyll。在产氢条件下,转基因藻lba的净光合放氧速率比849低。结果为利用豆血红蛋白特性通过基因工程手段提高莱茵衣藻产氢量提供基础实验数据。
从四川、浙江、山西、北京等地采集冬季产气良好户用沼气池及沼气工程中的沼液样品作为微生物接种源,在实验室条件下进行了500ml反应器的梯度降温模拟沼气发酵试验, 筛选出5个在21℃ 、18℃ 和15℃等不同温度下均可正常产气的沼液样品Z-2、 Z-3、Z-6、Z-8 和Z-10, 选取其中3个产气量较高的沼液样品Z-3、Z-6和Z-10作为接种源,进一步建立了2 500ml反应器实验室模拟15℃低温沼气发酵系统,经过连续传代筛选获得一个在15℃低温下产气量较高且稳定的沼气发酵系统Z-6,产气率达到0.15m3/m3d。提取该系统内沼气发酵微生物宏基因组DNA,以pBluescript SK(+)质粒为载体成功构建了约10 000个克隆的沼气发酵微生物宏基因组质粒文库。随机分析文库中的克隆结果表明,该文库的外源片段平均长度约为5kb,文库总容量为48 Mb,插入片段带型多样性较高。该文库的建立为沼气发酵过程中水解酶基因资源的挖掘利用奠定了基础。
实验选取鸡粪和猪粪进行好氧堆肥发酵,研究畜禽粪便腐熟过程中酶活性和微生物的变化趋势以及相互联系。结果表明:过氧化氢酶活性和纤维素酶活性在堆肥初期较高,随后迅速降低,最终过氧化氢酶维持在9~12ml/g之间,纤维素酶维持在12.37~15.07mg/(kg·h)之间,而脲酶活性变化趋势为"升高-降低-升高"。细菌数量变化趋势为"低-高-低";放线菌为"高-低";真菌为"高-低-高"。通过相关分析发现,放线菌可能是影响堆肥中过氧化氢酶和纤维素酶的关键因素。鸡粪中放线菌与过氧化氢酶呈极显著正相关;猪粪中放线菌与过氧化氢酶和纤维素酶呈显著正相关;鸡粪+猪粪中放线菌与过氧化氢酶和纤维素酶呈极显著正相关。
目的: 真核细胞表达小鼠淋巴细胞抗原CTLA-4胞外段肽,研究表达肽段与抗原呈递细胞B7分子结合后减轻小鼠淋巴细胞刺激后的增殖抑制,从而启动T淋巴细胞进一步增殖。方法:从小鼠脾脏淋巴细胞获得总RNA,通过逆转录PCR扩增出CTLA-4全长基因,克隆并测序。依据胞外段序列和真核表达载体pcDNA3.1序列,合成引物扩增胞外片段,两者经内切核酸酶处理、连接构建重组表达pcDNA3.1载体,重组质粒经测序验证后,采用lipofectamine 2000转染入小鼠肝癌细胞Hepa1-6,经G418筛选获得稳定表达细胞株。结果:获得小鼠CTLA-4胞外段真核表达载体和小鼠肝癌细胞Hepa1-6稳定表达转染细胞株,制备了CTLA-4胞外肽段,经His标签抗体和小鼠CTLA-4抗体Western blot检测表达蛋白带均呈阳性。结论:获得CTLA-4胞外段肽,为进一步研究该肽的作用打下基础。
目的:克隆、表达和鉴定肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)P1蛋白羧基端基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法 在成功克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段并测序的基础上,将基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/P1(3 520~4 563bp),转化大肠杆rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用ELISA和Western blotting方法检测其抗原性。重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体。结果 重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白质纯度达95％以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。并成功获得两株高效价单克隆抗体。结论:本研究成功克隆和表达了肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,制备了抗肺炎支原体P1蛋白单克隆抗体,为肺炎支原体诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。
以嗜醋酸棒杆菌为出发菌株,经过片段化全基因组体外诱变、重组和连续的磺胺胍抗性筛选,获得一株L-脯氨酸的高产菌株。摇瓶发酵优化结果表明,葡萄糖、生物素和硫胺素的最适用量分别为16%、300μg/L、400μg/L,最适pH为6.8~7.0,装液量为25ml/500ml摇瓶,发酵培养72h后L-脯氨酸产率高达到75.6g/L,与对照相比提高了5%。考察了50L发酵罐中细胞生长对L-脯氨酸产量的影响,补料分批发酵结果表明(比生长速率分别为0.06/h、0.08/h和0.1/h),比生长速率在0.08/h左右时L-脯氨酸的产率最高,L-脯氨酸的比生产速率QP达到0.091 g/(g.h),产率高达82.1 g/L,比优化前提高了14%。
p53作为肿瘤致病的关键因子人们已经进行了广泛的研究,microRNA参与肿瘤的发生也已经成为了不争的事实,但目前关于p53与miRNA的调控关系还不是很清楚。就p53与miRNA存在的可能调控模式及p53对miRNA功能与合成方面的影响进行了综述,并结合已有的研究绘制了可能的p53与miRNA调控模式图。
随着人类基因组测序计划的结束,对基因表达产物的分析已经成为研究热点,而有关蛋白质的技术亦得到了不断地发展与完善。血清分泌蛋白质组在肿瘤中起着重要作用,目前已经有不少分泌蛋白作为肿瘤标志物用于临床检测和预后判断。现对血清分泌蛋白质组在肿瘤领域的研究方法及研究进展进行了综述。
microRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物中,不编码蛋白质的短序列RNA,它广泛参与真核生物的生长发育、新陈代谢和应激反应等生命活动。但绝大多数miRNA的生物学功能还不清楚,通过灵敏的定量检测方法,了解miRNA在不同组织部位的时空表达,是探究其功能的重要环节。现着重介绍了2类7种基于PCR技术的miRNA定量检测方法的基本原理和实验流程,并分析了这些定量检测技术间的异同和适用范围。
桃儿七的主要活性成分是鬼臼毒素,在医药领域具有重要的应用价值。目前商用桃儿七主要来自野生资源,过度采挖已造成桃儿七在世界范围内濒临灭绝。综述了桃儿七的植物学特性,以及近年来通过细胞工程(组织培养、人工快繁、大规模细胞培养、毛状根培养)和内生菌发酵等生物技术手段生产鬼臼毒素的研究进展及存在的问题,旨在为该领域今后的相关研究提供背景资料。
紫草素及其衍生物在医药、食品、化妆品和印染等领域有着巨大的市场潜力,如何提高它们的产量已成为该领域研究的热点。综述了调控紫草素及其衍生物的合成和积累方法,主要包括高产细胞系的筛选、生产培养基的改良、外加物和外加条件的影响、基因工程调控、生物反应器的影响及分析和提取纯化技术等,并对有关紫草素及其衍生物今后的发展方向进行了展望。
D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase:oxidoreductase, DAAO, EC 1.4.3.3)是一种以黄素腺嘌呤(FAD)为辅基的典型黄素蛋白酶类,可氧化D-氨基酸的氨基生成相应的酮酸和氨。在体内D-氨基酸的代谢中起着重要作用。主要介绍了D-氨基酸氧化酶的生理功能和应用、表达条件优化及通过定点突变对酶学性质的研究。
作为转基因育种研究的核心技术成果,转化事件的知识产权保护为转基因作物产业化提供了重要的权利保障。目前世界主要农作物的转化事件绝大多数被孟山都、先正达、拜耳等国外公司所掌握,其中约有40%的转化事件正在全球申请同族专利保护,有22件已在我国申请,并且有6件已获得授权。国外转化事件专利的权利要求平均约20项,重点保护了侧翼序列和插入序列等关键技术特征,限制了任何未经许可而进行商业化改造或利用的可能。我国几乎还没有转化事件专利,"华恢1号"虽然比较接近,但保护强度不够。因此我国必须重点培育转化事件的自主知识产权,加强对国外专利的追踪分析,提高我国转化事件专利保护的精准度,最终构建知识产权全程保护体系。
