中国生物工程杂志

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陈晓丽朱化彬郝海生杜卫华赵学明孙艳艳胡传活王栋

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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本文综述了猪冻存精子顶体、质膜和线粒体的形态学变化及其对精子受精能力的影响，同时分析了冻融精子中所发生的蛋白质、DNA等生物大分子的变化及其可能对冻存精子质量及受精能力的影响，指出冷冻保存过程对精子蛋白质、DNA等生物大分子质和量的影响是精子冷冻损伤的实质,应用先进的蛋白组学进行猪精子冷冻损伤机理研究，有助于深刻揭示冷冻损伤的分子机理，为推动猪精液冷冻保存技术研究取得突破性进展提供理论依据。

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人FBXO31蛋白的原核表达及抗体制备

黄海丽郑文岭赵蕊严启涛蔡翠霞张宝马文丽

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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[摘要] FBXO31位于人染色人体16q24.3，是一个乳腺癌候选抑癌基因。为了获得抗FBXO31的多克隆抗体，构建了FBXO31基因的原核表达质粒pET-28a-FBXO31。将表达pET-28a-FBXO31转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，IPTG诱导表达融合蛋白。融合蛋白主要以包涵体形式存在，常规方法纯化包涵体。将纯化的pET-28a-FBXO31融合蛋白用于免疫新西兰大白兔获得抗血清，用pET-28a-FBXO31对抗血清进行分离纯化，得到抗FBXO31多克隆抗体。用Western印迹和免疫沉淀对其进行初步鉴定。获得了兔抗人FBXO31的多克隆抗体，为进一步研究FBXO31的生物功能提供了有用的工具。

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核苷二磷酸激酶A的定点突变及C4S突变体的制备和活性研究

陈蕴如郭朝万黄增委钱垂文张晓伟王一飞熊盛

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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目的：对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)二硫键异构的关键残基C4进行定点突变，构建、表达并纯化C4S突变体，测定其磷酸转移酶活性和DNase活性，研究二硫键异构对NDPK-A活性的影响。方法：以pBV220-nm23-H1质粒作为模板，通过设计合适的引物对NDPK-A进行定点突变，将第4位半胱氨酸突变为丝氨酸，构建NDPK-A C4S突变体；在大肠杆菌BL21中表达，DEAE-sepharose Fast Flow与Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B纯化目的蛋白，获得均一重组蛋白，纯度达到98%；DNA序列测定及重组蛋白的肽质量指纹图谱（PMF）分析均证明构建正确突变体；高效液相色谱法(HPLC)与DNA消化法分别测定野生型NDPK-A与C4S突变体的磷酸转移酶活性与DNase活性差异。结果：NDPK-A C4S突变体的磷酸基转移酶与DNase酶活性均高于野生型NDPK-A。结论：NDPK-A [ ﹡国家自然科学基金(30873082), 国家科技支撑计划 (2008BAI63B05), 教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-07-0376)，暨南大学211计划。 ﹡﹡通讯作者，Tel:86-020-85220504; Fax:86-020-85220504; E-mail: xiongsheng@jnu.edu.cn]缺失二硫键后，活性增高。NDPK-A形成链内二硫键可能是其活性负调控模式之一。

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热稳定α-半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

李荷游娟顾取良杨红

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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克隆前期筛得分枝犁头霉Absidia ramosa WL511的热稳定α-半乳糖苷酶cDNA基因aga（GenBank No. DQ234280），将aga基因插入表达载体pPICZαA并电转化整合到毕赤酵母P. pastoris GS115的染色体上。30℃、甲醇流加量0.5%（V/ V）时，酵母发酵上清液中酶活达32 U/ ml。纯化后酶的比活力为137 U/ mg， SDS-PAGE显示单一条带，凝胶过滤和SDS-PAGE估算其分子量分别为348 kDa 和87 kDa，该酶为四聚体结构，糖基化导致重组蛋白的分子量比原酶大6 kDa。该酶等电点为 5.2，最适反应温度73 ℃，最适 pH 6.8，60℃以下及pH 5.5-9.0范围内活性稳定。75 ℃时保温2小时保留54 %的酶活，85 ℃时酶活完全消失。以对硝基苯酚-α-D-半乳糖苷为底物，该酶Km值为0.42 mmol/Lol/L；Vmax为413 U mg-1；kcat为64531 min-1。

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电融合技术进展及其在干细胞研究中的应用

屈娅徐海伟阴正勤

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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电融合作为细胞融合的技术之一，在单克隆抗体制备、基因转移、抗肿瘤免疫等研究中占据了重要作用。目前电融合技术已经被广泛应用于发育生物学，以阐明胚胎发育过程并培养优良的品系。电融合技术结合体细胞核移植技术和体细胞重编程等技术可建立符合伦理学原则、避免排斥反应的个体化多能干细胞。本文就电融合技术在发育生物学和干细胞研究中的应用作一综述。

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根癌农杆菌介导深绿木霉高产漆酶菌株的构建和筛选

段兴鹏唐俊陈捷陈红漫任大明

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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利用根癌农杆菌介导技术（ATMT）转化深绿木霉（Trichoderma atroviride）T23，共获得6个稳定的转化子。利用愈创木酚法对转化子进行筛选，发现3株转化子产漆酶能力显著高于出发菌株T23。在限碳培养基中, 转化子TA5的漆酶酶活为25.3 U/mL显著高于发菌株。研究发现TA5所产漆酶较适宜酸性条件，当pH为3.5时，漆酶活性最高。在温度为18℃ 时，漆酶活性最高。

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浅谈生物医药产业技术创新战略联盟

苏月关镇和刘先宝敖翼

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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本文详细介绍了产业技术创新战略联盟的定义，分析了国外生物医药领域产学研合作的先进经验，阐述了国外（美国）生物医药领域产业技术创新战略联盟运作模式及借鉴意义，深入探讨了目前国内生物医药产业技术创新战略联盟的现状及存在的问题，并从政府、企业、高校及研究机构以及联盟本身四个层面提出生物医药产业技术创新战略联盟的发展思路和对策。

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萜类化合物在植物间接防御中的作用

周妮朱莉郎志宏黄大昉

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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植物受到虫害后释放萜类化合物吸引害虫天敌的间接防御是一种新颖且环保的抗虫模式。植物受到害虫危害等因素诱导后做出响应，在体内经过一系列复杂调控，释放萜类物质，害虫天敌顺着这些萜类物质找到害虫，通过捕食或寄生于害虫体内的方法来消灭害虫。在实际应用中，可考虑利用直接和间接防御相结合的防治方法。

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氯霉素和四环素阻碍细菌蛋白分泌的研究进展

吴琼靳野郑海学刘湘涛

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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氯霉素和四环素发挥活性的一个途径就是阻碍细菌蛋白质的分泌，其分泌功能是由其氨基端的信号序列决定的，该序列能将蛋白质引导到由SecY， E， G，和A 组成的转运蛋白复合体上。蛋白的转运还取决于融合蛋白的折叠特点，蛋白质转运到周质后的错误折叠可导致毒素聚集体形成，快速折叠还会使转运复合体发生拥堵，使所有的蛋白质分泌都受到抑制，导致细胞死亡。抗生素氯霉素和四环素处理细菌后会导致转运复合体中SecY的降解，造成致命的蛋白拥堵。本文就抗生素氯霉素和四环素的扰细菌蛋白质合成的作用机制以及导致SecY的降解来发挥阻碍细菌蛋白质分泌活性的一个新模式进行概述，以期为研究新的能靶向细菌的治疗方法提供科学依据。

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基因组重排技术应用与进展

卢圣国李霜朱建国孟庆雄

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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基因组重排技术结合了传统诱变技术和细胞融合技术，是一项对整个微生物基因组重排的新型育种技术。基因组重排技术通过多亲本原生质体递归融合，可以使工程菌快速获得多样复杂优良表型，并且无须了解其基因组学、代谢组学等具体背景。本文介绍了基因组重排技术的过程及应用，展现了基因组重排技术的优点，并给出了基因组重排技术的发展在未来的应用情景。

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禽流感病毒H9N2血凝素基因和神经氨酸酶因在真核酵母菌中的表达

张烨于在江唐启慧陈禹保辛丽陈永坤陈清轩舒跃龙

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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目的克隆、表达和鉴定禽流感病毒H9N2血凝素基因（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶基因（Neuramidinase，NA）序列，为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆禽流感病毒H9N2全长HA、NA基因并测序的基础上，将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上，构建了重组表达质粒pMETA/HA(52bp -1545bp)，pMET A/NA(121bp-1254bp)，电转化真核酵母菌pMAD16，甲醇诱导表达，利用Ni2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化，并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达，SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体，蛋白纯度占总蛋白的95％以上，ELISA和Western Blotting实验证实，重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H9N2 HA、NA基因序列，为禽流感病毒H9N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。

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人组氨酸磷酸酶PHP14的原核表达及其体外互作蛋白的研究

徐安健蒋单懿黄凌云谷俊朝肖雪媛何大澄

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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目的：表达和纯化人组氨酸磷酸酶PHP14蛋白，并寻找与其存在体外相互作用的蛋白。方法：PCR扩增PHP14的全长cDNA，并将其克隆至pGEX4T原核表达载体，构建重组表达质粒。用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株，经IPTG诱导后，使用Glutathione Sepharose 4B凝胶颗粒进行亲和纯化，通过SDS-PAGE电泳确定融合蛋白的表达。进行GST-Pull down实验，寻找体外与PHP14相互作用的蛋白，并进行质谱鉴定。结果：在大肠杆菌BL21中成功了表达出了PHP14的可溶性融合蛋白；经Glutathione Sepharose 4B凝胶颗粒纯化后，获得了纯化的GST-PHP14融合蛋白，GST-Pull down实验和质谱鉴定结果发现PHP14与HSP90在体外存在相互作用。结论：实现了PHP14的原核表达和纯化，发现PHP14与HSP90在体外可能存在相互作用。

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水稻XIOsPR10蛋白的原核表达及其RNase活性研究

郭迟鸣毛倩王丽娟李东霄杨晓坡郭立佳汪卫李敏郝国静陈亮

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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PR10（病程相关蛋白10）类蛋白与植物的抵御外来病害及系统获得性抗性（SAR）有着紧密联系，而且许多PR10类蛋白都具有RNase活性，并通过这种活性抵抗外源病害。本实验根据获得的XIOsPR10基因，将其构建到pET28a中，通过原核表达及磁珠纯化获得目的蛋白，通过RNA消化实验证实XIOsPR10重组蛋白具有RNase活性，进一步揭示了XIOsPR10蛋白的功能。

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人SSX2IP与14-3-3η蛋白相互作用的研究

王佳琦李璞施慧莉霍克克

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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人类SSX2IP是SSX2蛋白的相互作用蛋白，它与肿瘤的发生、发展有着密切的相关性。为进一步阐明人类SSX2IP蛋白的潜在功能，我们以其作为诱饵蛋白对成人肝cDNA文库进行酵母双杂交筛选，结果筛到了SSX2IP的一个新相互作用蛋白14-3-3η。利用GST Pull-down实验和细胞内免疫共沉淀实验在体内外验证了该相互作用的真实性。通过免疫荧光共定位实验发现SSX2IP和14-3-3η共表达于HeLa细胞时，它们共定位于胞质及核周。利用CCK-8法检测SSX2IP和14-3-3η对HEK293T细胞增殖的影响，发现共转染SSX2IP和14-3-3η后，HEK293T细胞的增殖速度有所提高。这些结果为进一步深入研究SSX2IP与14-3-3η的相互作用及其生物学功能提供新的线索。

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RNA干扰NRP2基因表达对胃癌细胞SGC7901裸鼠移植瘤的抑制作用

连海峰吴小翎彭阳

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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目的：探讨特异性抑制NRP2基因表达对人胃癌细胞SGC7901裸鼠移植瘤生长及淋巴管新生的影响。方法：采用小RNA干扰方法，构建shNRP2质粒，稳定转染入SGC7901细胞株，Westen blot检测转染前后NRP2蛋白的表达。建立人胃癌细胞SGC7901裸鼠移植瘤模型，随机分为shNRP2组(实验组)、shCon组(HK阴性对照组)和正常对照组，观察移植瘤的生长情况。6w后处死裸鼠，免疫组化检测NRP2蛋白的表达及微淋巴管密度（Micro-vessel density,MLD）。结果：成功构建shNRP2质粒，与另两组比较，shNRP2组细胞NRP2蛋白表达明显降低，且移植瘤组织生长、NRP2表达及MLD明显受抑制。结论：抑制NRP2基因的表达，可以抑制胃癌裸鼠移植瘤的生长及淋巴管的形成，NRP2基因有可能成为一个潜在的胃癌生物治疗靶点。

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邻近多位点基因突变的组合大引物PCR策略

赵广荣梁玲玲刘春杰祝琳琪

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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本文报道了一种新的组合多位点突变策略，通过单管中三阶段聚合酶链式反应（PCR）得以实现。在第一阶段，PCR扩增出多位点突变大引物，然后在第二阶段延伸大引物，在第三阶段获得全长突变基因序列。基于退火温度与热循环参数的组合大引物反应的优化，三个阶段中退火温度差异小（低于10°C），成功扩增出多位点突变基因序列和比邻突变序列。该策略是一种简单和高效的多位点突变方法。

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家蚕LongSAGE文库鉴定及延长标签的改进GLGI方法

甘丽萍席建徐丽司马杨虎徐世清

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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结合标签的基因序列延伸（GLGI）是随着基因表达序列标签（SAGE）应运而生的一种鉴定新标签的技术。为了克服该技术操作繁琐、成本高的弊端，本文根据已经构建的家蚕限性茧色品种的2个LongSAGE文库，选择30个差异表达的标签（tag）进行GLGI延伸。尝试了几个简化，（1）用total RNA代替mRNA进行dsDNA的合成；（2）调整磁珠吸附DNA的顺序；（3）在PCR反应中用普通的DNA 聚合酶代替高保真酶（Pfu）。结果显示，30个标签有27个获得有效扩增，扩增序列真实包括了SAGE标签的17bp序列，3个标签的结果符合NCBI的家蚕数据库已有注释，13个未注释标签经过延长后得到了注释，11个标签序列为待确定的新基因序列。这种简化能够作为家蚕SAGE文库其他tag和新基因研究的有效简化操作体系。与传统的方法相比，本操作方法减少成本30%以上，缩短操作时间20%。

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缺血后处理兔心肌蛋白质组学双向凝胶电泳分析

李利文周建美邹定全冉珂李李徐军美

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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目的　研究缺血后处理对缺血再灌注心肌保护的相关蛋白的变化。方法　将6只新西兰大白兔随机分为两组(每组3只):心肌缺血再灌注对照组(I/R组)和缺血后处理组(P组)。两组均接受左冠状动脉前降支阻断30 min, 开放再灌注180 min。缺血后处理组，结扎LAD 30min，然后灌注30s,阻断30s，重复4次，继而再灌注直至180min,分别取各组缺血区心肌进行二维凝胶电泳,利用ImageMaster 2D软件分析实验结果。结果　P组和I/R组对比,有11个蛋白表达发生了显著变化,其中表达增强的有7个蛋白,表达降低的有4个蛋白。结论　这些差异表达的蛋白可能在缺血后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护中发挥了作用。

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细胞核受体LXRβ的体外酶标测活方法的建立与应用

蔡怀涵王璐谢元翼刘旭东宋青

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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目的：克隆并表达大鼠细胞核受体LXRβ配体结合区（LBD）序列，并进行配体依赖性受体与共激活因子结合区短肽相互作用的酶标法分析，建立简易经济可靠的体外高通量筛选LXR调节剂方法。方法：从含大鼠LXRβ cDNA序列的pSG5/rLXRβ上扩增LBD区序列，测序核实序列后，将此序列克隆入表达载体，构建原核表达载体pET28a(+)-rLXRβ-LBD；将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达重组蛋白，通过SDS-PAGE、Western blotting检测，及Ni2+亲和层析柱分离纯化；建立ELISA方法检测配体依赖性受体-共激活短肽相互作用。结果：重组蛋白rLXRβ-LBD在大肠杆菌中高效表达（占菌体总蛋白30%），SDS-PAGE显示在36kD处有免疫特异性蛋白，纯化后全长蛋白占90％以上。ELISA结合测试显示在激动剂猪脱氧胆酸二甲酰胺存在时，rLXRβ-LBD能与共激活短肽结合，亲和力与双荧光酶报告基因测活结果吻合。结论：成功克隆并表达rLXRβ-LBD序列，建立起ELISA筛选方法，为LXR-LBD配体功能活性的研究和配体的高通量筛选提供新方法。

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有机磷诱导拟南芥差异蛋白表达及其对酯酶同功酶活性的抑制

丛靖宇高仙灵朱宏万东莉李国婧张镝杜红王瑞刚

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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研究植物响应Ops的分子机理对于建立有机磷生物修复技术具有重大的理论意义和实践价值。本文以拟南芥为例，研究了有机磷胁迫下酯酶同功酶及其可溶性总蛋白的响应。结果表明，有机磷明显抑制了植物的生长发育，并可通过根部吸收的方式迅速进入拟南芥体内，通过抑制酯酶同功酶活性对植物造成胁迫。同时，发现在拟南芥体内存在1个有机磷诱导下的差异表达蛋白，该蛋白与1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RuBisCO）大亚基高度同源。

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泰国生物产业发展现状和趋势分析

李瑞国尹军祥张大璐

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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泰国是农产品生产和出口大国，政府十分重视生物产业的发展，通过建立高层管理机构、出台优惠政策、制定发展规划，在生物农业、生物医药和生物能源等产业方面取得了较好的进展。未来泰国将更加重视政府指导作用，进一步完善法规建设，加大人才引进力度，实施产业优惠政策，加强生物资源和知识产权保护，重点发展生物农业、生物医药和生物能源产业。

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细菌鬼影在核酸疫苗研究中的作用

靳小攀季守平

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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免疫应答水平低下是制约DNA疫苗发展的一个障碍。细菌鬼影（bacterial ghost, BG）是利用φX174噬菌体的裂解蛋白将革兰氏阴性细菌裂解后形成的空腔，它保留了细菌结构的完整性，具有免疫佐剂的特性，可以作为递送载体，靶向性的将DNA疫苗导入到抗原递呈细胞，从而提高DNA疫苗的免疫应答水平，此外，装载核酸疫苗的细菌鬼影可以通过多种方式进行免疫，例如，肌肉注射、皮下注射、口服、粘膜免疫等，更是从根本上提高了DNA疫苗的免疫水平，因此可以说BG是一个极具潜力的核酸疫苗递送载体。本文就BG的特性及其在DNA疫苗递送载体中应用的最新进展做一综述。

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2010年第7期封面目录

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-1.

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添加胰蛋白酶促进Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062 产谷氨酰胺转胺酶?

程力张东旭堵国成陈坚

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 0-0.

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研究了添加胰蛋白酶对Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062合成谷氨酰胺转胺酶的影响。结果表明，添加胰蛋白酶可以提高发酵过程中谷氨酰胺转胺酶的酶活。摇瓶培养中，在发酵起始时添加200U/mL的胰蛋白酶，谷氨酰胺转胺酶的酶活最高达到了6.61U/mL，比对照提高了27.1%。初步研究表明，添加胰蛋白酶可以直接切割发酵过程中产生的酶原，使其被快速地转化为成熟酶，因此推测胰蛋白酶提高谷氨酰胺转胺酶酶活的原因是解除了酶原的产物抑制作用，产生更多的酶原，从而促进了产酶。

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泰国生物产业发展现状和趋势分析

李瑞国尹军祥张大璐

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 116-120. https://doi.org/Q81

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泰国是农产品生产和出口大国，政府十分重视生物产业的发展，通过建立高层管理机构、出台优惠政策、制定发展规划，在生物农业、生物医药和生物能源等产业方面取得了较好的进展。未来泰国将更加重视政府指导作用，进一步完善法规建设，加大人才引进力度，实施产业优惠政策，加强生物资源和知识产权保护，重点发展生物农业、生物医药和生物能源产业。

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研发动态

中国生物工程杂志. 2010, 30(07): 121-123.

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2010年, 第30卷, 第07期　
刊出日期：2010-07-25

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