2009年, 第29卷, 第04期 
刊出日期:2009-04-25
  

  • 全选
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    研究报告
  • 朱镭,张政希,倪国新,徐学敏,林标扬,李伟
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 1-5.
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    C8orf32是一种功能未知基因,其mRNA含量在乳腺癌组织中显著高于正常乳腺组织。将其开放式阅读框插入pGEX-6P1原核表达载体T7启动子控制下的GST编码基因下游,构建了C8orf32蛋白表达质粒pGEX-6P-C8。表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,成功表达了GST- C8orf32融合蛋白。经带有GST标签的位点特异性蛋白酶切割除去GST-C8orf32融合蛋白的GST标签,获得了N端带有8个多余氨基酸残基的C8orf32蛋白,蛋白纯度为95%左右。N端氨基酸序列分析表明该蛋白N端氨基酸序列正确,质谱鉴定进一步证明所表达C8orf32蛋白的正确性。用制备的C8orf32蛋白免疫新西兰白兔,获得了能够正确识别C8orf32蛋白的抗血清。该蛋白及其抗体的成功制备,为进一步研究C8orf32蛋白的结构功能和体内分布打下了基础。
  • 高丹丹,彭正华,杨旭,毕研伟,李智华,姬秋彦,李建芳,李健峰,徐维明
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 6-11.
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    制备16型人乳头瘤病毒mE6Δ/mE7蛋白与I型人单纯疱疹病毒VP22Δ蛋白的治疗型分子内佐剂融合蛋白疫苗,并检测其免疫原性和抗肿瘤相关生物活性。通过克隆HSV-1 VP22Δ及HPV-16 mE6Δ/mE7基因,构建pET28a-VP22Δ-mE6Δ/mE7原核表达载体。重组质粒在Rosetta(DE3)宿主菌中进行诱导表达,表达蛋白经分离、复性后,通过镍离子亲和层析进行纯化,纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot 鉴定,并免疫BalB/C及C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性。结果显示,VP22Δ-mE6Δ/mE7蛋白以包涵体形式表达,分子量约为34kDa,表达量约占菌体总蛋白的45%。该蛋白免疫小鼠后血清特异性IgG、特异性淋巴细胞增殖效果及对TC-1致瘤小鼠的肿瘤治疗效果均高于无佐剂单一重组蛋白疫苗。以上结果说明,所获得的重组融合蛋白具有较好的免疫原性和抗肿瘤活性,为治疗型HPV分子内佐剂疫苗的进一步研究奠定了基础。
  • 汪洋,马明浩,冯震,吴叶林,张绪瑛,金明飞,黄静,吴自荣
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 12-16.
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    目的:获得有活性的人谷氨酸脱羧酶65(human glutamate decarboxylase 65,hGAD65)用于Ⅰ型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)检测。方法:将hGAD65基因插入质粒pET32a(+)中,与硫氧还蛋白(thioredox)及六聚组氨酸(hexahistidine)融合,由IPTG诱导融合蛋白(Trx-hGAD65)表达,经两次镍离子亲和层析纯化,通过薄层层析和ELISA研究hGAD65及Trx-hGAD65的活性。结果:在大肠杆菌中实现hGAD65的可溶性表达,经亲和层析得到较纯hGAD65和Trx-hGAD65蛋白,二者具有相同酶学活性,但Trx-hGAD65稳定性更高,并能检测出T1DM患者血清中的hGAD65抗体(hGAD65-Ab)。结论:Trx-hGAD65能在大肠杆菌中可溶性表达,从而为Trx-hGAD65用于T1DM诊断、预防和治疗打下基础。

  • 马义,余榕捷,曾乐,谢珊珊,洪岸
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 17-21.
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    利用基因重组方法构建RMBAY的原核表达载体pKY-BAY,并研究其生产的优化条件。选用大肠杆菌偏爱密码子,用PCR方法合成全长RMBAY多肽基因,并定向插入到高效表达载体pKYB-mcs中,用大肠杆菌ER2566进行表达,融合蛋白经Chitin-Beads柱纯化后,结合在柱上的融合蛋白用β-巯基乙醇诱导蛋白内含肽的N端自动切割,释放目的肽,目的肽由质谱鉴定。 实验结果表明:利用载体pKY-B在大肠杆菌ER2566中,RMBAY能够实现高效表达;在优化的生产条件下,RMBAY的产量可达到6.7mg/L发酵产物,纯度大于98%,质谱鉴定RMBAY的分子量为3.887kDa. 与理论值相符合。
  • 张月,刘舒,马静,李慎涛,王炜,张权庚,赵文明
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 22-27.
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    PCR扩增OPG-HSP65基因,构建原核重组表达载体pET-28a-OPG-HSP65,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达产生包涵体形式的目的蛋白。对重组蛋白进行Western blot检测表明,重组蛋白能与抗His-Tag单克隆抗体及鼠抗人OPG单克隆抗体特异性结合。对重组蛋白进行尿素洗涤纯化,进而透析、复性。经破骨细胞生长抑制实验和抑炎实验表明,重组蛋白能减少破骨细胞生成及减轻迟发型超敏反应小鼠模型炎症反应。
  • 刘子杰,翁亚光,李素彦,施琼,蔡燕,刘斌,张燕,阎琛
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 28-34.
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    目的:探索与Mps1蛋白有相互作用的CENP-E蛋白结构域。方法:将重组质粒pEGFP-CENPE2(674~1085位氨基酸)、pEGFP-CENPE3(1200~2134位氨基酸)转染人胚肾293(HEK293)细胞,采用受体漂白荧光共振能量转移方法(FRET方法),检测EGFP-CENPE2、EGFP-CENPE3和Mps1间的能量转移率(Ef), 进一步用免疫共沉淀方法验证FRET的实验结果。结果:重组质粒转染HEK293细胞后经激光共聚焦显微镜观察重组质粒表达的融合蛋白与Mps1都存在着共定位;FRET检测结果显示EGFP-CENPE3和Mps1间的能量转移率为[(12.63±0.48)%, n=30],pEGFP-CENPE2和Mps1间的能量转移率为[(3.07±0.21)%, n=30],与对照组[(2.96±0.27)%, n=30]比较pEGFP-CENPE3和Mps1间的能量转移率差异存在显著性(p<0.05),免疫共沉淀实验结果显示EGFP-CENPE3与Mps1蛋白间存在相互作用。结论:FRET技术和免疫共沉淀实验证明了EGFP-CENPE3与Mps1间存在着相互作用。
  • 廖明媚,张阳德,段菁华,何剪太,潘一峰,邓星明,赵劲风
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 35-38.
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    目的:探讨抗凋亡蛋白Mcl-1在GCDA诱导的肝癌细胞耐药中的作用及其机制。方法:培养3种肝癌细胞系,用免疫荧光法和Western blot技术检测Mcl-1的表达;GCDA±CYC处理HepG2细胞,采用Western blot技术检测Mcl-1的半衰期变化;用抗癌药物Irinotecan与GCDA对HepG2细胞进行处理,采用MTT法和Western blot技术分别检测细胞增殖抑制率和Mcl-1的表达变化;用RNA干扰技术下调Mcl-1,检测化疗药物对HepG2细胞的敏感性。结果:Mcl-1在肝癌细胞中广泛表达;GCDA能延长Mcl-1的半衰期至6h以上,并明显减弱化疗药物对抗凋亡蛋白Mcl-1的抑制作用,降低癌细胞的药物敏感性;RNA干扰下调Mcl-1能增加癌细胞的药物敏感性。结论:胆盐(GCDA)能诱导HepG2细胞产生耐药性,其作用机制可能是通过延长Mcl-1半衰期增加其蛋白稳定性和抗凋亡作用来促使肝癌细胞抗药的。

  • 王芳,杜庆安,朱宛宛,吴迪,徐艳玲,关云谦,张愚
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 39-45.
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    目的:探讨在分化扩增期采用连续低密度传代的方法是否能降低小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的前体细胞中Oct-4阳性细胞的比例,以及对神经分化能力的影响。方法:采用“五步法”将小鼠胚胎干细胞向神经元分化,进入扩增期后采用连续低密度传代的方法连续传10代。然后应用细胞免疫组化鉴定Oct-4阳性细胞、神经元与胶质细胞、流式细胞仪检测Oct-4阳性细胞比例、凋亡试剂盒测定细胞凋亡。结果:流式细胞仪检测出扩增期连续低密度传代得到的前体细胞中Oct-4阳性细胞的比例由16.17±4.8%降至4.33±1.63%,扩增期低密度传代细胞和正常高密度传代细胞的细胞凋亡率鉴定分别为15.16±3.64% 和11.88±2.63%,步骤5诱导分化后的细胞GFAP和Tuj-1免疫组化染色呈阴性。结论:低密度传代培养可以减少分化后Oct-4阳性细胞的比例,且该比例下降不是由Oct-4阳性细胞的凋亡引起的。同时可能是因为低密度传代培养和高密度相比引起了细胞的质变、或者改变了前体细胞向神经元分化的某种微环境,导致了前体细胞不能分化为神经细胞。提示高密度培养在前体细胞向神经元分化过程中具有重要作用,高密度和低密度培养的比较,提供了研究ES细胞向神经元分化机制的新平台和研究方向。

  • 于恒智,张守峰,扈荣良,张乐萃
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 46-50.
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    试验首先根据GenBank上所发表的狂犬病病毒CVS-24株糖蛋白基因序列,设计并合成一对特异性引物,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),获得糖蛋白全长cDNA,连接在pMD18-T载体上,测序证明克隆的正确性后,将其插入真核表达载体pIRES1neo,构建了糖蛋白单一表达载体pICG,表达质粒通过脂质体转染BHK-21细胞,在G418抗性压力下出现细胞克隆,通过PCR检测,确定启动子与糖蛋白基因在细胞基因组中共同整合。借助Western blot检测,证明所表达的糖蛋白与狂犬病抗血清有特异的反应性。采用间接ELISA法,筛选出3株高效表达糖蛋白的细胞株,分别命名为ICG1、ICG2、ICG3。
  • 年四季,袁青,殷幼平,王中康
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 51-55.
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    用柑桔溃疡病致病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri(Xac)全菌免疫小鼠,提取小鼠脾细胞mRNA,RT-PCR扩增小鼠抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),采用linker (Gly4Ser)3连接VH和VL,构建用于核糖体展示方法筛选阳性单链抗体(scFvs)的文库。通过将scFv文库DNA转化大肠杆菌JM109,随机挑取克隆子测序以分析单链抗体文库的多样性。结果显示,用柑桔溃疡病菌免疫后的小鼠抗血清效价为2500倍左右,扩增的VH大小为350bp左右,VL的大小为650bp左右,linker连接后的单链抗体文库DNA大小为1200bp左右。测序结果显示,单链抗体文库多样性好。以Xac为靶,筛选到了抗Xac的特异性抗体,说明该抗体库可用于柑桔溃疡病菌单链抗体的筛选。
  • 陆庆宇,王其海,张占钰,袁道鹏,高伟,仓怀兴,毕汝昌
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 56-60.
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    福志贺氏菌属是一类革兰氏阴性杆菌,是引起人类细菌性痢疾的主要致病源。以福志贺氏痢疾杆菌2a型301株全基因组为模板、以pET22b-(+)为载体、克隆了一个关键基因:组氨酸合成途径中双功能焦磷酸水解酶和磷酸核糖环化水解酶蛋白(简称:sf2088)。以BL21(DE3)为表达菌株,优化表达条件,获得了可溶表达的蛋白。经过亲和层析和分子筛层析获得目标蛋白。采用分析超速离心和动态光散射实验,对纯化后的蛋白进行稳定聚集状态的条件搜索,结果发现锌离子对稳定其聚合状态很重要。通过正交实验,获得蛋白保持稳定聚集态的条件。这对该酶的进一步研究奠定了基础。
  • 谢涛,方慧英,诸葛斌,诸葛健
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 61-66.
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    研究了不同磷浓度时渗透压对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响。结果表明,不同磷含量时,产甘油假丝酵母甘油合成越多,分泌至胞外和积累于胞内的甘油也越多,其最大甘油合成量存在一个最适渗透压。同样;在相同渗透压下,其最大甘油合成量也存在一个最适磷浓度。在相同磷含量时,渗透压增高能够促进胞内聚磷酸盐积累;当渗透压相同时,培养基中磷含量增加,胞内游离磷和聚磷酸盐均增加。在生长稳定期后期,富磷可以促进胞内游离磷和聚磷酸盐积累显著增加。经分析发现,产甘油假丝酵母胞内积累甘油与聚磷酸盐,可能对克服对数生长期细胞数量少而渗透压胁迫大的困境发挥了极其重要的作用,从而能维持其生长稳定期较高的生物量、细胞存活率和甘油产量。
  • 田鑫,廖强,党楠,朱恂,王永忠
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 67-72.
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    对平板式生物膜反应器内,流量及底物浓度范围分别为37.8~1080ml/h、0.05~10g/L的不同生长条件下光合产氢细菌生物膜生长特性进行了实验研究,讨论了不同水力及营养条件对沼泽红假单胞菌生物膜表面覆盖率、膜厚、干重和密度的影响。实验结果表明,不同水力及营养条件对生物膜生长速率及结构具有重要影响。在相同的时间间隔内,在高流速条件下光合细菌菌落生长较快,但过高的液体流速会导致部分生物膜脱落;高流速条件易使生物膜形成薄而致密的结构。光合细菌生物膜在循环液底物浓度较高时生长较快,密度也最高;而贫营养条件可以促成结构疏松生物膜在固液界面的形成,这种生物膜结构有利于微生物在低底物浓度条件下底物在生物膜内的传输。
  • 技术与方法
  • 金玉莲,金宁一,任云霞,吕瑜峰,庞广昌
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 73-77.
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    Calsenilin/KChIP3/DREAM, 是脑中高表达蛋白,最初发现是因其与presenilin 和钙离子结合而得名。作为转录因子抑制因子,该基因在细胞核内具有多种功能。该基因在钙离子作用下细胞核内常常与c-fos、prodynorphin等基因的启动子下游的特异性DRE位点相结合,调节这些基因的表达。另一方面,作为钾离子通道结合蛋白,该基因具有4种isoforms,其中KChIP1广泛存在于各种组织中而KChIP2只在心脏中特异表达,KChIP3和 KChIP4则在脑中显示较高的表达。4种基因在C-端结构非常相象,N-端则显示多样性。除此之外,和许多基因相似,calsenilin经PKC、CKI、PKA等激酶作用可产生多位点的磷酸化,其中主要位点Ser63的磷酸化可以阻止caspase-3对该基因的降解作用。另一方面,Calsenilin作为转录因子激动因子结合于维生素D和视黄酸效应因子启动子上游促进转录的进行。 到目前为止,Calsenilin/KChIP3/DREAM在细胞核内具有双重基因表达调控作用,即当结合于启动子上游时显示正调控而当结合在启动子下游时显示负调控。为了更加深入研究calsenilin的功能及寻找新的受其调控的基因,首先制备可特异性识别的单克隆抗体。利用RT-PCR 技术,从人脑中提取RNA扩增calsenilin全基因,克隆于pGEX-4T-2原核细胞表达载体中,经IPTG诱导表达、Gluthathion Sepharose 4B纯化得到GST-calsenilin/DREAM/KChIP3重组蛋白,并免疫小鼠。通过PEG细胞融合得到单克隆抗体。经细胞免疫染色及Western blotting检测显示说明本实验得到单克隆抗体可以用来进行细胞免疫染色及Western blotting等检测。该抗体的成功制备,为今后对calsenilin/DREAM/KChIP3调控基因表达的更深入研究提供了有效工具,也填补了国内尚无该基因单克隆抗体资源的空白。
  • 易学瑞,袁有成,陈文吟,苏蔚,张峰,刘振扬,孔祥平
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 78-82.
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    目的:建立化学发光Southern blot检测细胞内HBV DNA的方法,同时检测3种不同靶点抗乙肝药物的体外作用。方法:用地高辛标记HBV探针,优化杂交条件,检测来自HepG2及HepG2.2.15 HBV DNA复制中间体;利用建立的化学发光Southern blot检测HBV DNA的方法检测经拉米夫定、Bay41-4109、α-Galcer以不同药物浓度处理的HepG2.2.15HBV DNA复制中间体的水平。结果:(1)标记的HBV探针的检测灵敏度为0.1pg,杂交系统的检测灵敏度为1pg,可检测到HepG2.2.15细胞内的HBV DNA特异性信号;(2)以该法检测胞内HBV DNA可见3种药物都有明显的抑制作用,其半数有效量(IC50)分别为1.53μmol/L、0.41μmol/L、0.01μmol/L。结论:胞质HBV DNA的水平能准确地反映不同靶点抗HBV药物的抗病毒效果,建议在观察药物特别是中药抗病毒研究中采用。
  • 万成,许杨,李燕萍,季宏飞
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 83-87.
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    红曲菌是一种具有较高食用和药用价值的丝状真菌,能够产生红曲色素、莫纳可林K等多种生理活性物质。通过分析比较培养基、蛋白质裂解液组成以及水化上样条件对双向电泳结果的影响,建立了红色红曲菌蛋白质组的双向凝胶电泳体系,为从蛋白质水平研究红曲菌及其次级代谢产物的生物合成提供依据。结果表明:用YES培养基培养红色红曲菌6 d,TCA丙酮法提取菌体总蛋白质,蛋白质裂解液组分为8mol/L尿素,2mol/L硫脲,4 % CHAPS,1 % DTT和2 % Bio-lyte,可获得蛋白质样点数量多,清晰度高的双向电泳图像,为进一步研究红曲菌蛋白质组奠定了基础。
  • 研究简报
  • 邵楠,王虹,李荣贵
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 88-92.
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    采用克隆基因测序技术,从荧光假单胞菌GcM5-1A基因组文库中筛选到了天冬氨酸转氨酶的编码基因aspC。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因,插入pET-15b构建重组表达质粒pET-15bAAT,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中高效表达,利用亲和层析法初步分离纯化了重组蛋白。生物活性分析表明,纯化的重组天门冬氨酸转氨酶具有氨基转移活性。
  • 曹小红,毛德志,许程剑,鲁梅芳,韩朝龙,王晓烨,霍哲,王春玲
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 93-97.
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    初步分析了分离出的一种分子量为55kDa,具有免疫活性的新型家蝇蛹D-半乳糖结合凝集素的结构,为深入研究其结构与功能之间的关系提供大量的信息。首先通过凝胶电泳染色确定此新型家蝇蛹凝集素具有糖链结构,借助蛋白质测序仪、分光光度计比色、β-消除反应、红外光谱以及原子力显微镜技术对其结构进行初步分析。此种家蝇蛹凝集素是一种蛋白和糖含量分别为97.36% 和2.1% 的球状单体,直径为75nm左右。肽链与糖链的连接方式为O-糖苷键型,肽链的N-末端封闭,糖环为吡喃型,为进一步分析其结构提供了可靠的依据。
  • 综述
  • 杜娟,胡红刚,侯玲玲
    中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 98-103.
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    近年来IL-13受体IL-13Rα2的研究已经成为一个新兴热点,IL-13Rα2在许多肿瘤细胞细胞表面存在特异性高表达,而在正常组织中不表达或表达量很低,通过IL-13Rα2介导的毒素融合蛋白靶向治疗肿瘤也已成为肿瘤诊断和免疫治疗研究中的重要方面。随着对IL-13Rα-结构和功能及其与肿瘤关系研究的不断深入,将为肿瘤的靶向治疗提供新的思路,为肿瘤的临床治疗提供新的理论依据。对IL-13Rα2在不同肿瘤中的表达及IL-13和不同毒素融合得到的毒素融合蛋白在细胞和动物体内等不同水平上对肿瘤治疗的作用做出了相应概括,并对通过IL-13Rα2介导的毒素融合蛋白治疗肿瘤机理的研究以及融合蛋白方法改进及其它相关治疗方法等方面作出综述。
  • 专题
  • 中国生物工程杂志. 2009, 29(04): 104-109.
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