孢粉素(sporopollenin,SP)是一种高度交联的天然高分子共聚物,构成花粉和孢子的外壁,可以保护其内部的生殖细胞不受外界恶劣环境的影响,如紫外线、缺水、氧化自由基和微生物的侵袭
[1]。苔藓和蕨类的孢子以及部分藻类的细胞壁也含有孢粉素
[2]。孢粉素堪称自然界最坚固的有机物,能够抵抗物理、生物、化学腐蚀,被誉为植物界的金刚石。花粉或孢子在地层里经过上亿年,由SP构成的外壁结构仍然清晰可见,因此孢粉素在考古学、地质学、气候学、植物学等领域均有重要的研究价值。近年来,随着孢粉素分子结构的解析,SP在药物载体、口服疫苗载体、影像诊断、细胞支架和生物传感等生物医学领域也得到广泛的应用。
1 孢粉素的结构
成熟的花粉粒包括外壁、内壁以及包裹在内部的精子细胞和营养细胞(
图1a)。外壁由孢粉素构成,内壁主要由纤维素构成。孢粉素微囊(sporopollenin exine capsule, SEC)是指去除植物花粉或者孢子表面的油脂、纤维素内壁以及包裹的细胞后得到的微囊,一般直径在15~50 μm(
图2a)
[3]。
图1 花粉切面的结构Fig. 1 The structure of the cross section of pollen (a) The cross section of a pollen The external layer is marked blue, while the inner layer is marked yellow[4] (b) The nano channels in the external layer of SEC[5] |
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图2 孢粉素的表面形态和化学结构Fig.2 The surface morphology and chemical structure of sporopollenin (a) Scanning microscope image of SEC[3] (b) The average molecular structure of pine SP[7] |
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最早对孢粉素的化学研究始于John(1814年)和Braconnot(1829年),他们分析了多种花粉的成分,将其中不溶解的部分命名为花粉素(pollenine),指出它是组成花粉粒外壁的坚韧、抗腐蚀的物质。1928年Zetzsche发现从孢子的外壁也可以获得具有相同化学性质的抗腐蚀物质,于是将花粉和孢子的外壁合称为孢粉素。SP由碳、氢、氧三种元素按照一定比例构成,具有高度稳定复杂的交联结构,无法用常规的化学或生物方法降解成单体,因此孢粉素的结构很长时间得不到解决。20世纪六七十年代,Brooks和Shaw
[6]用光谱法分析了天然孢粉素和类胡萝卜素聚合物的氧化降解产物,认为孢粉素可能是一种类胡萝卜素或类胡萝卜素酯的氧化聚合物,但并未阐明其单体的具体化学结构以及交联方式。直到2019年,孢粉素的分子结构才被麻省理工学院Whitehead生物医学研究所的Jing-Ke Weng研究组解析
[7]。为了将孢粉素降解,他们使用高能球磨机将松花粉磨成粉末,用纤维素酶将内壁降解后得到孢粉素碎片。然后用硫代酸解法分解碎片,将可溶和不溶产物分别用液相色谱-紫外光谱-质谱联用技术(HPLC-UV-MS)和固态核磁共振光谱进行表征。最终揭示SP的平均结构近似二重对称,包括两条脂肪酸衍生的类聚乙烯醇链(类PVA单元,包含38个碳),一端是α-吡喃酮,另一端的羧基通过酯键交联。两条链由7-氧-对-羟基肉桂酰C16脂肪族单元通过1,3二口恶烷(缩醛)交联在一起构成孢粉素的基本单位(
图2b)。部分C16脂肪族单元(15%)只有一端交联,另一端是游离的羟基。类PVA单元可能通过醚键与类甘油结构(R')连接。孢粉素主要通过酯和缩醛交联成牢固的结构,而其他天然聚合物以及人工合成的聚合物通常只有一种类型的交联占优势,如角质(酯交联)、木质素(醚交联)、纤维素(糖苷键交联)、聚乙烯醇缩丁醛(缩醛交联)。酯键能对抗酸性条件,缩醛能抵抗强碱性条件。孢粉素高度交联的结构和不同单体交错出现的疏水亲水成分使其难溶于大部分溶剂,并且抵抗酶和微生物的降解。
2 孢粉素的物理化学性质
SP具有抗氧化、耐酸碱、耐高温、耐高压、抗紫外线和抗生物降解性能。既不溶于水,也不溶于大部分的无机和有机溶剂
[8]。
室温下用浓硫酸与醋酸酐混合液或用70%硝酸浸泡10 min对孢粉素的红外光谱特征无明显影响。但过度氧化(加热或延长时间)会造成孢粉素外壁变暗、尺寸增大、降解等后果
[9]。
SP不溶于大部分的有机和无机溶剂,如酸(硫酸、磷酸、盐酸、氢氟酸)、碱(氢氧化钠、氢氧化钾)、脂溶剂(热丙酮、氯仿-甲醇、苯、乙醚-乙醇、哌啶)和去垢剂(Triton-X100、Tween 20)
[10]。但熔融氢氧化钾、部分有机碱(2-氨基乙醇、3-氨基丙醇和2,2',2''-次氮基三乙醇)、强氧化溶液(如过氧化氢和硫酸混合液)、90℃以上的4-甲基吗啉-
N-氧化物可以溶解SP。其他如铬酸、酸化次氯酸钠和硫酸-重铬酸清洗液也可以溶解SP,溶解的程度与植物品种、孢粉的新鲜程度和提取过程有关
[8]。SP在油和有机溶剂,尤其是乙醇中具有高度的单分散性,能够迅速形成混悬液。
SP具有高度热稳定性,加热到100℃以下没有变化;100~180℃会发生缓慢的颜色改变,180℃以下基本不影响其化学结构,如果继续升温,SP会逐渐热解,脱水、失去羟基、芳香族特征基团渐增。180~220℃时变暗,释放出水、甲烷和二氧化碳;超过220℃时SP迅速变暗,释放出更多挥发性化学物质
[11]。
SP特殊的多重交联结构使其能够耐受10 GPa的静态压
[12]。孢粉素微囊具有很好的弹性和延展性,挤压后还能自行恢复原来的形状
[13]。药物可以通过贯穿外壁的纳米尺寸的管道装载进去(
图1b),SEC的弹性使包进去的药物通过反复挤压又能够被释放出来
[14]。SEC脱水后皱缩塌陷,干燥的孢粉素微囊在5~10 t/cm
2的压力下会产生裂痕,能够让酵母细胞进入微囊,但在溶液中微囊又膨胀恢复原状,裂痕关闭
[15]。因此,除了装载小分子药物,利用SEC的弹性和裂痕的“开关”性能,还可以在微囊内装载细胞和细菌等微生物。
孢粉素能够吸收紫外线和可见光,对保护内部的遗传物质有重要作用。SP能够阻断80%以上的紫外辐射,因为SP含有可吸收紫外线B(UV-B)的对-羟基肉桂酸。而酵母、明胶或淀粉微囊不具备抗氧化和抗紫外线的功能
[16]。
SP能够抵抗大部分生物酶的降解。蛋白酶、核糖核酸酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶等都无法分解SP,因此花粉外壁能够在地层中长期保存。吃花粉的昆虫只能消化花粉内壁的纤维素和花粉内包裹的蛋白质、糖类等营养成分,但无法消化其外壁的孢粉素
[15]。授粉后花粉内壁会产生一种混合酶(酸性磷酸酶、核酸酶、酯酶和淀粉酶)来瓦解SP形成花粉外壁的萌发孔。某些细菌在特定pH或有氧条件下也能够降解SP。以花粉为食的真菌类根瘤菌也能够产生水解SP的酶。此外,角麦蛾口器的分泌物能分解孢粉素,但到底是哪种成分发挥作用仍不清楚
[17]。另外,花粉在血液中也可以降解,降解机制尚不明了
[18]。
综上所述,SP具有优良的抗物理、化学和生物腐蚀特性,是一种非常稳定的天然高分子聚合物。但有些植物的孢子或花粉外壁非常薄,去除内壁后可能导致外壁的碎裂或塌陷。例如,悬铃木、三叶豚草、玉米花粉和小球藻的外壁很薄,如果去除其他成分,其外壁稀疏的SP不足以抵抗机械或热应力
[1]。
3 孢粉素的制备和功能化
SP对大部分化学处理和消化酶极其稳定,因此需要结合多种方法从花粉和孢子中提取高纯度的SP。通常采用高温和化学腐蚀法制备孢粉素,首先用热水除去花粉表面的糖类,然后用热丙酮移除表面的脂质,接着用碱除去花粉内部的原生质,最后用酸水解内壁的纤维素,得到纯孢粉素外壁(
图3)。碱处理后的花粉仍然存留纤维素内壁,形成双层微囊。一步制备单层SEC的方法虽然简便,但往往残留一些杂质。例如,Erdtman醋酸酐分解法(乙酰解法)是纯化花粉的常用方法,用浓硫酸与醋酸酐的混合液(1/9,
V/V)处理花粉。或用6 mol/L盐酸在110℃下处理花粉6 h可以一步除去花粉的脂质、多糖和蛋白质
[16]。用85%磷酸(
m/V)在70℃加热5 h,能够除去87%的蛋白质
[19]。SEC除去蛋白质后成为无过敏原的载体,生物相容性增加。
图3 孢粉素微囊的制备流程Fig.3 The preparation process of the sporopollenin exine capsule |
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对孢粉素微囊的外侧或内侧进行修饰可以实现药物的可控释放,为酶催化反应提供有效的支持面。SP表面可电离的基团(酚和羧酸)使其能够稳定地分散在油和水溶液中。通过把表面羟基(醇、酚和羧基)转化为极性的盐或非极性衍生物(醚、酯和乙酸)可以改变孢粉壁的极性
[15]。用紫外线/臭氧联合处理能够氧化SP的脂肪族和芳香族结构,芳香环打开形成R
2C=O功能基团,使疏水的SEC转化为亲水微囊,显著提高了SEC对可可脂的装载率(93%),并且能够促进细胞黏附和增殖
[20,21]。用铂修饰的花粉颗粒可催化H
2O
2分解产生气泡,推动微型机器人在溶液中运动,提高其结合和清除重金属的能力
[22,23]。将SEC用氯磺酸磺化后能够催化木糖脱水生成α-呋喃甲醛
[24]。另外,利用石墨烯、碳纳米管等纳米材料对SEC进行修饰可以改善其电导率,构建高度敏感的生物电子传感平台
[25,26]。修饰氧化铁的SEC在磁场下可以实现定向输送。
4 孢粉素微囊的特点和应用
SEC来源丰富,主要来自石松、绿藻、松树、向日葵、麦子和玉米等常见植物或农作物。石松作为一种中药材,其孢子石松子是最丰富的孢粉素来源。全国玉米花粉年产量高达150万吨,舟山地区人工采集黑松花粉,每年可产3 000多吨
[27]。花粉尺寸从微米到毫米级别都有,形状多样,包括圆形、椭圆形、饼状、三角形、梭形、花生形等。表面雕纹丰富多彩,有刺状、瘤状、网状、条纹状、棒状等。其独一无二的三维结构和表面形态是植物分类的重要依据。SEC除了高度稳定,还可以长期保存,尺寸和形态非常均一,表面含有丰富的羧基、羟基和酚基,能够功能化或者与其他材料复合;另外SEC制备简单,生物相容性好,无免疫原性;SEC表面的纳米孔道增加了材料的比表面积,有利于捕获癌细胞或者目标分子,提高生物传感器的灵敏度;SEC巨大的空腔还可以作为天然微反应器。以上独特的性质使SEC在药物载体、生物影像、细胞生长支架、微反应器、微型机器人、掩味剂和环境污染物去除等方面得到广泛的应用。以下主要总结SEC在生物医学领域的应用进展。
4.1 药物载体
同一品种的花粉或孢子尺寸和形态基本相同,非常适合于作药物释放载体。与人工合成的囊泡(如脂质体)相比,SEC具有稳定性高、来源丰富、价格便宜、无免疫原性、内腔大、载药率高等优点,但SEC尺寸较大,属于微米载体,比较适合作口服载体和体外诊断设备,也可以吸入和外用,较少用于静脉注射
[16]。
铂修饰的花粉微型机器人能够负载抗肿瘤药物阿霉素,在体外显示良好的抗癌效应,对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率达到41%,可望用于癌症的非侵入性治疗(
图4a~c)
[22]。SEC耐酸碱的性质和可控装载、释放以及对肠黏膜的吸附使其成为一种良好的口服药物载体。口服药物,尤其是蛋白质类药物(如生物酶)进入胃中常常会被强酸性胃液变性或被胃肠道的各种酶降解。用孢粉素微囊作为运输酶的载体,可以避免酶活性受损。新加坡南洋理工大学Nam-Joon Cho课题组用向日葵SEC装载白蛋白(BSA),包封率达到40%以上。将装载白蛋白的SEC制成片剂并包被聚丙烯酸树脂Eudragit L100肠溶衣,在pH 1.2的酸性模拟胃液(SGF)中不释放BSA,而在pH 7.4的模拟肠液(SIF)中BSA在8 h内完全释放(绿色曲线)。没有肠溶衣包被的BSA在2.5 h内迅速释放(黄色曲线),肠溶衣包被的BSA在6 h后才开始缓慢释放(
图4d)
[14]。Barrier等
[28]用石松的SEC分别装载易氧化的鱼肝油、可可脂以及辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶,发现SEC能够防止不饱和脂肪酸的氧化和酶的变性。以上结果证实SEC是一种优异的肠道药物释放平台。SEC还用于装载营养品,如鱼油,起到抗氧化的作用,保护不饱和脂肪酸,保存期延长2个月,并显著提高肠道吸收利用率
[16,29]。
图4 孢粉素微囊在生物医学中的应用Fig.4 Application of sporopollenin microcapsule in biomedicine (a) Optical image of DOX-loaded Pt-pollen microrobots[22] (b) Fluorescence image of DOX-loaded Pt-pollen microrobots[22] (c) Cell viability results of MCF-7 cells for DOX-loaded Pt-pollen microrobots[22] (d) In vitro release of BSA[14] (e) Release of the gadolinium contrast agent[30] |
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由于孢粉素的双亲性,SEC可以包裹各种极性和非极性的物质,如核酸、蛋白质、维生素等。用SEC装载半托拉唑(治疗胃溃疡的质子泵阻滞剂)
[31]、布洛芬(解热镇痛剂)
[32]、5-氟尿嘧啶(癌症化疗药物)
[33]获得了良好的缓释和治疗效果。利用孢粉素耐酸的特性还可以把疫苗装载在孢粉素微囊里制备成口服疫苗,减少了静脉或皮下注射的痛苦。小鼠体内实验证实负载卵白蛋白的孢粉素微囊可以穿过肠道上皮,激活免疫系统产生特异性抗体
[34]。
SEC装载药物的技术包括被动、挤压和真空填充法。真空填充法是用真空把微囊内部的空气抽空,药物通过SEC表面的纳米通道进入微囊。这样避免了有机试剂、高剪切力等方法对药物的损伤。被动填充法是把药物和SEC混合后搅拌,药物被动扩散到SEC里。压缩填充法先把SEC压扁后再加到药物溶液中,促进药物摄取到SEC里。真空填充法的装载效率最高,因此得到更广泛的应用
[35]。SEC在高压下产生裂痕,甚至可以把较大的物质如酵母菌包进去,并且保持细菌的活性
[36]。SEC装载药物的效率与药物的分子量和电荷有关,如蛋白质的装载效率比多肽低(空间位阻较大),对分子量相同的溶菌酶和α-乳清蛋白,等电点高的溶菌酶(pI 11)载药量明显高于α-乳清蛋白(pI 4.2~4.5)
[37]。
4.2 生物影像
SEC还可以装载核磁共振造影剂,如钆造影剂。核磁共振血管造影要求造影剂在血管中停留更长时间,以达到影像平衡。血浆中含有可以消化SEC的酶,使SEC缓慢释放造影剂,4 h达到最大释放量,而在PBS缓冲液中SEC几乎没有释放钆造影剂(
图4e)
[30]。
4.3 生物传感器
Wang等
[38]将还原石墨烯修饰的SEC沉积在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)超薄基底表面,把抗体连接到石墨烯上,然后利用场效应晶体管检测了前列腺特异性抗原(PSA),比传统的基于二维石墨烯薄膜的生物传感器灵敏性提高了3~4个数量级,检测限达到1.7×10
-15 mol/L,并且能够在4 s内快速响应(
图5)。将石墨烯修饰的SEC沉积在二氧化硅表面,把抗体连接到石墨烯上,用场效应晶体管检测补体蛋白6(C6),检测限也可达到1×10
-15 mol/L,比传统的基于石墨烯的生物传感器灵敏度提高10
5倍
[25]。他们还将碳纳米管修饰的向日葵SPC置于聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜之间制备了可穿戴电子皮肤传感器,外加压力引起复合膜厚度的改变,从而导致电流的变化,该传感器能够高度灵敏地检测到1.6 Pa的细微压力
[26]。Zhang等
[39]用基于荧光磁性SEC的微型机器人检测粪便中的艰难梭菌毒素,最低检测限达到1.73 ng/mL,具有良好的选择性,比传统的ELISA法检测时间缩短了1/8。
图5 用孢粉素微囊生物传感器检测PSAFig.5 Detection of PSA using sporopollenin exine capsule-based biosensor (a) The rGO-modified SEC biosensor fabrication procedure (b) Dose-dependent responses to target PSA (c) Response time of rGO-SEC biosensor detection against 1×10-12 mol/L target PSA[38] |
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4.4 细胞生长支架
用紫外线/臭氧联合处理的SP能够促进细胞黏附和增殖
[20,21]。用铂修饰的花粉颗粒可催化H
2O
2分解产生气泡,推动微型机器人在溶液中运动,显著提高其结合和清除重金属的能力
[22,23]。用浓硫酸刻蚀技术对菊花花粉进行刻蚀,花粉表面的“纳米笼”结构能够与肿瘤细胞伪足的尺寸和结构精确匹配,伪足(黄色虚线)深入到纳米笼内部(红色虚线圈),产生强大的黏附力,从而捕获肿瘤细胞(
图6a、b)
[40]。未经过修饰的菊花SEC对人乳腺癌细胞(MCF-7)、皮肤鳞癌细胞(A431)、肝癌细胞(HepG2)、宫颈癌细胞(HeLa)和肺癌细胞(A549)都显示出高度捕获率(
图6c、d),并成功用于癌症患者循环肿瘤细胞的捕获与检测。
图6 孢粉素微囊捕获癌细胞Fig.6 Capture of cancer cells using sporopollenin exine capsule (a) TEM image of a captured MCF-7 cell on EChry film (b) Schematic illustration of the filopodia of cancer cell stuck into the nanocage (c) The number of MCF-7 cells captured on EChry film as a function of loaded cell number (d) Capture yields of various cancer cells on EChry film[40] |
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4.5 其他用途
SEC是一种天然的掩味剂,包裹药物或营养素(如布洛芬、鱼油)后具有味觉隔断效应,有利于抗拒药物苦味的孩子服药。SP优异的耐压性能使其在人工心血管移植、组织工程方面也有潜在的应用价值
[13]。SP的抗氧化性能使其成为食物化学抗氧化剂的天然替代品
[5]。另外,SEC内部的空腔还可以成为原位合成有无机和有机纳米粒子的微反应器
[29]。SEC在清除环境重金属和油污的清除方面也有广泛的应用
[22-23,41-42]。
孢粉素的平均单体结构虽然已经揭示,但天然孢粉素聚合物结构是不均匀的, 其结构单元之间的交联方式以及不同物种孢粉素的结构差异仍然有待研究。另外,孢粉素如何组装成SEC表面丰富多彩的雕纹目前尚不清楚。探索表面雕纹形成的机制对揭示生命基本过程、指导人工孢粉素的合成具有重要意义。
对不同植物花粉或孢子的比较发现,在模拟消化液中,茶花花粉降解程度最大,而蒲公英花粉和石松子比较稳定
[43]。SEC口服后能够穿过肠壁进入血液和淋巴系统
[34,37],小鼠口服装载卵白蛋白的石松子SEC后血清中产生大量抗卵白蛋白IgG抗体
[44]。SEC怎样从肠道进入血液,在消化液和血液中的降解机制以及对免疫系统的影响机制仍不清楚。深入研究SEC在体内的代谢和降解机制以及免疫机制对其作为药物载体、疫苗载体等生物医学应用具有重要的意义。
5 结论与展望
孢粉素微囊作为药物、疫苗和影像诊断试剂的载体有得天独厚的优势。SEC与纳米材料复合物制备的生物传感器在疾病标志物,如蛋白质、DNA、RNA等生物大分子以及外泌体的检测方面有广阔的应用前景,为生物医学的发展提供了契机。
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