将狂犬病病毒中和性单链抗体基因克隆入原核表达载体pET-PE40，经酶切鉴定及序列测定，成功构建了重组免疫毒素原核表达载体。IPTG诱导后目的蛋白获得高效表达，SDS-PAGE分析目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于菌体中，表达量占菌体总蛋白的32.29％。包涵体蛋白经体外复性及离子交换色谱柱、疏水作用色谱柱、Sephadex G200凝胶过滤层析柱三步纯化后获得纯度大于96％的目的蛋白，间接免疫荧光染色检测表明重组免疫毒素与狂犬病病毒感染细胞具有抗原结合活性，MTT试验显示，重组免疫毒素对狂犬病病毒感染细胞具有明显的杀伤作用，而对正常细胞无杀伤作用。
人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus, RSV)基质蛋白（matrix protein，M）在RSV形态发生上具有重要作用，因含有CTL抗原表位，在疫苗研究上具有一定意义。为此，应用RT-PCR 方法从感染RSV的HEp-2 细胞中扩增获得M蛋白基因，构建了含M基因的非复制型重组腺病毒并进行表达和鉴定。基因序列分析显示RSV M基因仅有一处碱基发生错义突变。非复制型重组腺病毒DNA分子FGAd/RSVM转染293细胞，观察到细胞出现CPE，RT-PCR发现M基因有转录，Western blotting及间接免疫荧光分析检测到M蛋白。成功克隆A亚型RSV Long株M基因，并获得一株可表达A亚型RSV M蛋白的非复制型重组腺病毒FGAd/RSVM，可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用。
目的 为了探讨吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)参与肝癌免疫逃逸的机制。方法 混合培养HepG2细胞和T淋巴细胞，在有或无1-甲基色氨酸(1-MT)存在下，用RT-PCR检测细胞中IDOmRNA的表达，流式细胞仪分析混合反应体系中HepG2细胞的凋亡率，MTT检测T淋巴细胞抗HepG2细胞的细胞毒活性。结果 混合反应体系中，HepG2细胞表达IDOmRNA的水平随着1-MT浓度的增高而降低；对照组及实验组（1-MT浓度分别为1.25 mmol/l，2.5 mmol/l，5mmol/l）中HepG2细胞的早期凋亡率分别为（3.48±0.34）%，（7.82±0.41）%，（18.62±0.42）%，（25.32±0.40）%（P<0.01），T淋巴细胞抗HepG2细胞的细胞毒活性分别为（17.36±1.24）%、（25.48±1.48）%、（32.89±1.73）%、（42.04±2.16）%（P<0.01）。 结论 HepG2细胞表达的IDO能抑制外周T淋巴细胞发挥抗肿瘤免疫作用，它可能参与了肝癌的免疫逃逸。
目的：提高复制型HBV转基因小鼠的遗传稳定性。方法：应用回交传代及双杂交育种法，经荧光定量PCR、ELISA和化学发光法研究HBV基因在小鼠体内的复制与表达。结果：HBV转基因小鼠已稳定传至第23代，血清HBsAg达4122.31±2044.74IU/ml，93.93%的转基因小鼠血清HBV DNA达104-106copies/ml，表达复制水平较早期有显著提高并稳定传代；雌雄小鼠之间表达水平无显著性差异。结论：该转基因小鼠经过培育传代，已成为一个高表达且遗传稳定的复制型HBV小鼠模型。
研究PLGA的不同组成对支架材料的力学性能、降解性能和生物学性能的影响。采用溶液浇注/颗粒沥取法制备出不同组成的PLGA多孔支架，对支架的力学性能和降解速率进行考察，同时将人真皮成纤维细胞接种于不同组成的PLGA支架材料上，培养不同时间后，检测细胞的粘附率和增殖率，以及细胞产生的总胶原含量，并通过扫描电镜观察支架上的细胞形态。结果显示，随PLA比例的增加，支架的力学强度增加，降解速率降低，但都不是线性变化。70:30比例的支架，拉伸强度最高，而70:30和80:20两种比例的支架，其降解速率没有显著性差异。PLGA不同组成的支架，均具有良好的细胞相容性，成纤维细胞粘附率和增殖率在三种比例的支架上没有显著性差异，细胞在支架表面生长良好，分泌大量的细胞外基质，细胞基本铺满整个支架。本文研究发现，PLGA的组成对支架力学性能、降解性能和生物学性能有细小但显著的影响，这将对组织构建选用PLGA支架材料提供有益的帮助。
AP2/ERF转录因子家族是植物中广泛存在的一类转录因子，AP2/ERF这类转录因子主要参与植物的细胞周期、生长发育以及生物和非生物胁迫相关基因的表达调控。由于拟南芥和油菜同属于芸薹属，具有相似的基因信息，利用油菜UniGene数据库，以拟南芥ERF转录因子保守序列为探针，通过电子克隆从一个UniGene Cluster中分离得到三个同类的AP2/ERF转录因子，从cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性分析、序列比对、进化树、功能域、二级结构、三级结构、无序化特性进行了预测和较为全面的分析。结果显示油菜来源的BnaERF1、BnaERF2和BnaERF3属于AP2/ERF转录因子的B-2亚族，是亲水性蛋白，在蛋白质的三级结构上与AtERF1相似。蛋白质无序化分析发现，油菜BnaERF1、BnaERF2和BnaERF3无序化程度小于拟南芥AtERF1。设计引物通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型双低油菜沪油15幼苗的DNA和cDNA中扩增了上述基因，初步分析BnaERF2没有内含子，BnaERF1和BnaERF3有内含子。另外，通过EST丰度分析显示，该类转录因子的表达最高峰在种子中，其次为花，在芽、茎和分生组织中没有检测出表达的存在。
15-羟基前列腺素脱氢酶（PGDH）属于抑癌基因，在多种肿瘤中表达缺失，在肿瘤的发生发展中起着重要作用。提取人正常大肠黏膜组织总RNA，利用RT-PCR方法扩增得到PGDH基因的编码序列，克隆入原核表达载体pBV220，测序鉴定正确后转化E.coli DH5α，经温控诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE和Western blot，证实为相对分子质量约为29000的PGDH-His6蛋白，表达产物以包涵体形式存在，3h诱导表达量最高,约占菌体总蛋白的30%。经Ni2+配体亲和层析纯化得到纯度大于95%的目的蛋白。重组PGDH简单复性后具有一定的生物活性，约为3.7×104U/mg，为下一步研究其在肿瘤中的作用奠定了基础。
将来自于肺炎克雷伯氏杆菌的甘油脱水酶基因插入到质粒pET28(a+) -yqhD的上游，并用SD序列隔开，串联构建重组质粒pET28(a+)dhaBCE-yqhD，转化到大肠杆菌E.coli novablue中进行共表达。结果显示：含有pET28(a+) dhaBCE-yqhD的重组菌在28℃条件下，IPTG诱导16h后，甘油脱水酶和yqhD氧化还原酶的酶活力分别达到35 U/ mg和 82 U/ mg ，而对照组检测不到甘油脱水酶酶活；当甘油浓度为55g/L，产物1,3-PD的产量可达39g/L；甘油浓度过量不利于产物合成，且产物1，3-丙二醇对合成反应具有一定的抑制作用。
为了探索原核生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在调控脂类代谢中的作用。PCR法扩增了鱼腥藻Anabaena sp. PCC 7120 PEPC基因中含保守结构域Fa 的一段基因片段pepcA，并将其克隆到pMD 18-T载体上。将pepcA正反向连接到穿梭表达载体pRL-489上BamHI位点之间，构建得带有pepcA正反义基因的载体pRL-Sen pepcA和pRL-Anti pepcA，转化入大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a宿主细胞中。分析结果表明：pepcA片段的转入对宿主菌的生长影响不大；与野生型细胞相比较，转反义pepcA片段E.coli中PEPC酶活性降低到野生菌的30.2%，蛋白合成减少23.6%，脂类的合成增加了46.9%，；而转正义pepcA片段E.coli PEPC酶活性是野生菌的2.38倍，蛋白合成增加了14.5%，脂类合成减少了49.6%；转基因菌中十八碳酸的含量明显增加。上述结果可能为利用原核生物做生物柴油原料提供线索。
为提高基因工程菌Bacillus subtilis WSHB06-07发酵生产角质酶的产量和生产强度，考察了pH（5.5~8.0）对菌体生长和产酶的影响。基于不同pH发酵过程中菌体比生长速率及比产物合成速率的变化，确定了pH两阶段控制策略，即0~4 h时控制pH 7.5，4 h后将pH调至6.5。通过采用这一优化策略，角质酶酶活有了较大的提高，达170 U/mL，生产强度为16.9 kU/(L·h)，比恒定pH 7.5控制模式下分别提高了122.6%和123.2%。
研究了溶氧浓度对产甘油假丝酵母分批发酵生产甘油过程的影响。实验结果表明：当溶氧浓度控制在30%时，C. glycerinogenes的甘油产量、得率和产率达到最高，分别为120.7 g/L、0.575 g/g和1.69 g/(L•h)，而糖酵解代谢副产物形成最少。当溶氧浓度为10%时，发酵过程呈现出“巴斯德效应”的特征，生成的酵解代谢副产物维持在较高水平。在快速生长阶段，随着溶氧从10%增加到60%，细胞呼吸类型表现为从厌氧呼吸向好氧呼吸转变，酵解代谢副产物依次减少。在生长稳定期，控制的溶氧浓度越高，酵解代谢副产物乙醇、乙酸等的生成减少。分别选用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret-like方程，能较好地模拟细胞生长、甘油合成和葡萄糖消耗的动力学过程。
分离去除高丰度蛋白成为血浆蛋白质组研究的关键问题之一。我们从已建株的17株抗人血浆白蛋白单克隆抗体库中选出一株合适抗体。该抗体用Protein G Sepharose 4B吸附，然后用交联剂DMP（Dimethyl pimelinediimidate chloride）使之与Protein G 蛋白共价交联。实验结果显示600µL（结合1mg抗体）胶能分离10µL血浆中的白蛋白和球蛋白。填料进行重复使用10次后吸附能力变化无显著改变。对填料的吸附蛋白进行MALDI-TOF/TOF 鉴定主要为白蛋白和球蛋白，及其碎片，但发现吸附的蛋白有转铁蛋白，纤维蛋白原，抗胰蛋白酶，前脂蛋白，Vitamin D 结合蛋白，Keratin 10和 CD5 antigen like蛋白。实验结果表明该方法能在固定目的抗体同时最大量地保持抗体活性，该方法有望在蛋白质组学研究的高丰度蛋白分离中得到广泛应用。
高甲基化的CpG岛所致基因表观遗传学转录失活已经成为肿瘤表观基因组学研究的重要内容。现在已有很多检测CpG岛甲基化的方法，但由于各自的局限，还没有建立一种能快速在全基因组水平上进行甲基化CpG岛的富集方法。本研究利用甲基化结合蛋白MBD2b具有特异性结合甲基化DNA的特性, 建立了一种基于DNA免疫共沉淀技术的全基因组甲基化CpG岛的富集方法。在大肠杆菌中表达重组的GST-MBD2b蛋白，通过Glutathione Sepharose 4B对重组蛋白进行纯化，制备成亲和层析柱，利用在不同的盐离子强度下甲基化DNA和非甲基化DNA的结合能力不同，对甲基化DNA进行富集。用甲基化酶SssI处理过的DNA片段与非甲基化DNA片段进行富集效率的检测，发现0.5M KCl的浓度是甲基化DNA片段和非甲基化DNA片段得以分开的临界条件。样品的富集效率用Real Time PCR进行检测。结果表明，这种方法能够实现对全基因组甲基化DNA的有效富集且最高的富集倍数可达到100多倍。富集到的甲基化DNA可以进行后续的定量PCR， DNA测序和全基因组芯片的分析等工作，为大规模分析全基因组CpG 岛甲基化的改变奠定了基础。
本研究以外源基因（RDV MP-）和玉米内源基因Zein作为PCR扩增对象，旨在建立一种简便有效的转基因玉米及其产品的二重PCR检测技术。转外源基因（RDV MP-）材料的常规PCR检测结果证明外源基因在转基因材料中可稳定遗传；对常规PCR检测的阴性结果材料进行二重PCR检测，扩增结果除进一步证实常规PCR检测的阴性结果结论外，还证明提取的植物总DNA质量符合试验要求，进而从二重PCR检测结果还得出常规PCR检测的阴性结果出错率为1.4%。此方法简单，实用，结果可靠，可适用于转基因植物及产品的检测。
构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3，表达重组GST-SUMO-3融合蛋白，制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示，通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3 N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致，重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功；重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21 (DE3) pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白，分子量为44.0 kDa，与预期分子量一致；采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔，获得人SUMO-3抗体；Western blot 检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3，ELISA检测结果成阳性，抗体效价约为1: 20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。
对于NDV不同基因型毒株的HN基因的氨基酸序列比较后发现，基因Ⅶ型的毒株在第65~75位的氨基酸序列较为保守，而其他各基因型在该区域则不尽相同。因此本文克隆了NDV基因Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ型的代表毒株La Sota、GX-2、F48E9的含有该区域的序列，并进行蛋白表达，通过特异性抗血清对表达肽段进行抗原性测定。应用表达的蛋白免疫SPF鸡，用ELISA检测各组的抗体水平。结果表明3个毒株在反应原性上存在差异。应用NDV F48E9强毒株攻毒，结果显示各多肽蛋白的保护率不同，表明在该区域这3个毒株之间存在着免疫原性差异。
Myostatin基因，是肌肉生长的负调控因子，通过下调MyoD的表达抑制骨骼肌细胞的分化，但具体机制目前尚未完全清楚。本研究以体外培养的猪骨骼肌卫星细胞为实验材料，利用RNAi 技术，以Smad3为靶基因进行干扰研究，研究干扰前后猪骨骼肌卫星细胞增殖情况的变化以及MyoD、Myostatin基因的表达规律，进一步阐述三个基因间的调控关系。结果表明，Myostatin通过下调MyoD的表达，抑制骨骼肌卫星细胞的分化，但这种抑制作用是受Smad3调节的。
本实验目的是在乳酸菌中表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori） 中性粒细胞激活蛋白(NAP)，口服免疫小鼠后检测其免疫原性。在实验中利用了分子克隆技术构建携带nap基因的重组原核表达质粒pNICE:sec-nap,将重组质粒转化乳酸菌NZ9000株，筛选鉴定阳性菌落，诱导表达的NAP蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。将雌性ICR（CV级）小鼠随机分为4组，分别用PBS、携带空质粒的乳酸菌、携带pNICE:sec-nap的乳酸菌、灭活的H.pylori 灌胃。免疫7次后检测其特异性IgG和IgA的产生。成功扩增了nap基因并构建了重组原核表达质粒pNICE:sec-nap，转化乳酸菌NZ9000后经nisin诱导可表达Mr约17kDa的重组蛋白，表达量约占菌体总蛋白量的9.5%，表达的蛋白能与兔抗H.pylori 血清特异性反应,具有良好的免疫原性。携带pNICE:sec-nap质粒的乳酸菌刺激产生的IgG水平明显高于携带空质粒组，与灭活H.pylori组没有明显的差异，但其刺激产生的IgA水平明显高于其他组。以上结果说明表达NAP蛋白的乳酸菌口服免疫小鼠后，能够刺激小鼠产生特异的IgG和IgA，对幽门螺杆菌疫苗的研究开发具有理论的意义。为乳酸菌作为抗原递送载体的研究和H.pylori口服疫苗的开发提供一定的实验基础。
为检测本课题组构建的枯草芽孢杆菌分泌表达载体pGPST中启动子和信号肽的活性，将β-半乳糖苷酶基因插入表达载体的多克隆位点，构建含有β-半乳糖苷酶基因的重组质粒pGPST-lacZ，重组质粒转化枯草芽孢杆菌，分别测定液体培养基中上清液和菌体沉淀中β-半乳糖苷酶的活性。培养上清液中的酶活在22h达到峰值，约为26mU/mL，之后开始下降；菌体沉淀中的酶活在14h最高，达6mU/mL，而阴性对照pGPST没有检测到酶活性。结果表明分泌型表达载体中的启动子和信号肽具有较好的活性，能实现异源基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。本试验为该表达载体的进一步研究和应用提供重要的数据资料，也为外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达提供参考资料。该载体将在研究外源基因在枯草芽孢杆菌中表达发挥重要作用。
逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白高效表达系统，它由逆转录病毒载体，包膜蛋白载体和包装细胞系构成，在基因治疗和生物制药领域都有很大的应用潜力。逆转录病毒和宿主细胞基因组的重组倾向于发生在转录活性区；口炎疱疹病毒-G蛋白 (vesicular stomatitis virus G, VSV-G)能有效扩大逆转录病毒感染宿主细胞的范围、提高逆转录病毒的感染效率；用高滴度的重组病毒感染细胞，经过简单的筛选即可获得高表达细胞株。本文对逆转录病毒表达系统的组成、感染的特点和机制及其应用前景作了概述。
Cecropin抗菌肽，又名天蚕素，是一类具有抗菌能力的小分子多肽，热稳定性好，抗菌谱广，在各个应用领域已经得到广泛的研究。本文就Cecropin抗菌肽结构与功能的关系、作用机制和其在转基因植物抗菌领域中的应用进行综述，转基因植物表达Cecropin抗菌肽具有应用优势和实用价值，Cecropin抗菌肽分子结构与作用机制探索的深入能进一步促进转基因植物抗菌研究的发展。
可转化大片段DNA载体系统主要包括双元细菌人工染色体BIBAC(binary bacterial artificial chromosome)和可转化人工染色体TAC(transformation-competent artificial chromosome)系统，它们能够高效克隆大片段DNA，在获取目的基因相关信息的同时转化植物得到转基因植株。本文综述了BIBAC和TAC载体的特点、种类、发展现状以及近年来在植物种质创新中的应用。同时，根据我国花生育种的现状，展望了可转化大片段DNA载体系统在利用野生花生资源改良栽培花生品种中的应用前景。
微生物脂肪酶在传统和新型工业催化领域中的应用越来越广泛与深入。作为脂肪酶规模化制备主要途径的高效重组表达，为脂肪酶催化剂的最终形成及工业催化奠定了坚实的技术基础。概述并讨论了微生物脂肪酶重组表达的最新策略和发展趋势，阐述密码子优化、融合共表达、杂合启动子、同源高效表达、细胞表面展示和表达文库的高通量筛选等技术特点及其表达应用现状，指出细胞表面展示表达和表达文库高通量筛选体系为脂肪酶重组表达注入强劲活力；在此基础上对几种代表性微生物脂肪酶的重组表达进展作一综述，为微生物脂肪酶的重组表达研究及工业生产提供借鉴。
生物传感器是近年逐渐发展起来的一种高新生物学分析检测技术，它将生物学或仿生学信号感应部件紧密连接或整合到传感系统内，具有特异、敏感、快速、便携以及操作简便等优点，发展非常迅速，并且被应用到医疗保健、食品工业、畜牧兽医等多个领域，已成为人们研究的热点之一。本文概述了生物传感器的概念与工作原理、分类、与主要领域的研究应用，分析了生物传感器的产业现状，优点与现存问题，并对其应用发展前景进行了展望。
